組織免疫熒光技術(shù)
原理及介紹：
免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及定量（熒光面積或平均熒光強(qiáng)度等）。
用途
檢測(cè)組織中某蛋白的表達(dá)，包括其表達(dá)與否、表達(dá)位置和相對(duì)含量。利用多色免疫熒光技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)蛋白，得到多個(gè)蛋白的共定位和表達(dá)熒光圖像，結(jié)果所含數(shù)據(jù)量更多，觀賞性更強(qiáng)。
組織 IHC 是應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位或定量研究，一張切片只能檢測(cè)一種蛋白、抗原。只需普通光學(xué)顯微鏡即可觀察，無需熒光顯微鏡。
材料與儀器
材料：
1xPBS緩沖液（pH7.2~7.4）：NaCl 137 mmol/L, KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3 mmol/L, KH2PO41.4mmol/L。
CB：檸檬酸三鈉 3g, 檸檬酸 0.4g。
1% 鹽酸酒精分化液：按體積比為濃鹽酸：無水乙醇 = 1:99 配制。
NGS：正常山羊血清，10% 及 1% NGS 用 1xPBS 稀釋。
一抗、二抗按需選擇購(gòu)買，盡量參考高分文獻(xiàn)，另可購(gòu)買抗熒光猝滅封片劑。
儀器：
烤片機(jī)、通風(fēng)櫥、免疫組化染色缸或盒、微波爐、濕盒、熒光顯微鏡、微波爐。
步驟
若為冰凍切片，則進(jìn)行以下步驟后直接進(jìn)行第二大步、第 5 步內(nèi)源性過氧化物酶阻斷
一、加固定劑（按下述固定劑選擇固定條件，任選其一）：
10% 中性緩沖福爾馬林：在室溫下固定 10 min；
冷凍丙酮：-20℃ 冷凍 10 min，風(fēng)干；
甲醇：-20℃ 冷凍 10 min；
3% 甲醛：室溫下固定 15 min；
3% 甲醛/甲醇：在 3% 甲醛溶液中室溫固定 15 min，之后直接放入甲醇溶液中 -20℃ 固定 5 min。
二、1xPBS 清洗 2 次，每次 5 min。
1、選取質(zhì)量較好，厚度均勻的組織切片并做好標(biāo)記，同時(shí)設(shè)立一張陰性對(duì)照切片；使用不同抗體的切片盡量選取連續(xù)切片，避免因組織差別大而影響結(jié)果分析的客觀性；
2、石蠟溶解：將切片置于 70℃ 原位雜交儀中，烤片 30 min (無烤片條件也可忽略此步直接進(jìn)行(2)，適當(dāng)增加脫蠟時(shí)間)；
3、脫蠟：將烤過后的切片迅速放入二甲苯中，2 次，各 5 min。
4、梯度水化：100%、90%、80%、70% 的乙醇中各放置 5 min，蒸餾水中放置 5 min；
5、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷：滴加 3% 過氧化氫，室溫于濕盒內(nèi)放置 10 min 后，蒸餾水中放置 1 min；
6、抗原修復(fù)：放置于 1 x CB 中，微波爐 80% 火力 4 min，40% 火力 8 min，冷卻至室溫；
7、（可選步驟）0.3% Triton室溫通透 15 min；
8、封閉：吸干組織周圍液體，滴加 10% NGS，放置于濕盒內(nèi)，37℃ 30 min或室溫 2 小時(shí)；
9、一抗：按抗體說明書建議比例使用 1% NGS 稀釋抗體；吸干組織周圍液體，滴加稀釋好的一抗，其中陰性對(duì)照組僅滴加 1% NGS，放置于濕盒內(nèi)，37℃ 孵育 2 小時(shí)，或 4 攝氏度過夜；
10、放置于 1xPBS 中清洗 3 次，每次 5 min；
11、二抗：吸干組織周圍液體，加入稀釋好的熒光二抗，室溫避光孵育1h 后，1xPBS 洗三次，每次 5 min；
12、染核：加入 Hoechst 熒光染料標(biāo)記細(xì)胞核，室溫孵育 15 min 后 1xPBS 洗兩次，每次 5 min；
13、封片：滴加一滴抗熒光猝滅封片劑于組織上，蓋玻片封片，置于顯微鏡下觀察拍照。
注意事項(xiàng)
1、若使用熒光標(biāo)記的一抗，則孵育完成后，1xPBS 清洗 3 次每次 5 min，直接進(jìn)行染核和封片。
2、為了長(zhǎng)期保存，請(qǐng)?jiān)?4℃ 下避光保存樣品。
3、若無抗熒光猝滅封片劑，則滴加一滴 1xPBS 后覆以蓋玻片，置于顯微鏡下觀察拍照，另外，注意避免長(zhǎng)時(shí)間照射樣品，防止熒光過快猝滅。
4、注意調(diào)整抗體的稀釋比例，盡量按照實(shí)驗(yàn)室已摸索的稀釋比例、抗體說明書以及文獻(xiàn)中比例配制。
5、若想同時(shí)檢測(cè)多種抗原，則需選擇種屬來源與樣本組織不同的抗體，按抗體各自的說明書推薦終濃度混合后滴加至組織上進(jìn)行孵育；二抗也按各自稀釋比例混合后進(jìn)行孵育，注意各熒光二抗波長(zhǎng)需不同。
6、拍照時(shí)注意調(diào)節(jié)光強(qiáng)及曝光時(shí)間等參數(shù)。
常見問題
1、組織細(xì)胞無著色：可能實(shí)驗(yàn)操作問題，包括實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)、實(shí)驗(yàn)材料異常、抗體選擇和抗體質(zhì)量問題等，或者本身蛋白不表達(dá)，這些均可通過設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照以及陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)來排除。
2、 染色過淺：可能由于封閉時(shí)間過長(zhǎng)，抗體濃度過低，抗體孵育溫度不當(dāng)或時(shí)間過短，操作過程中緩沖液殘留過多或者間接稀釋抗體濃度；應(yīng)根據(jù)具體原因進(jìn)行調(diào)整。
3、染色過深：可能由于封閉時(shí)間過短，抗體濃度過高，抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)，洗滌不充分（洗滌次數(shù)少或時(shí)間短），或者濾光片選擇不合適；應(yīng)根據(jù)具體原因進(jìn)行調(diào)整。
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