組織免疫熒光技術
原理及介紹：
免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及定量（熒光面積或平均熒光強度等）。
用途
檢測組織中某蛋白的表達，包括其表達與否、表達位置和相對含量。利用多色免疫熒光技術可同時檢測多個蛋白，得到多個蛋白的共定位和表達熒光圖像，結果所含數據量更多，觀賞性更強。
組織 IHC 是應用免疫學及組織化學原理，通過抗原抗體反應及呈色反應，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量研究，一張切片只能檢測一種蛋白、抗原。只需普通光學顯微鏡即可觀察，無需熒光顯微鏡。
材料與儀器
材料：
1xPBS緩沖液（pH7.2~7.4）：NaCl 137 mmol/L, KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3 mmol/L, KH2PO41.4mmol/L。
CB：檸檬酸三鈉 3g, 檸檬酸 0.4g。
1% 鹽酸酒精分化液：按體積比為濃鹽酸：無水乙醇 = 1:99 配制。
NGS：正常山羊血清，10% 及 1% NGS 用 1xPBS 稀釋。
一抗、二抗按需選擇購買，盡量參考高分文獻，另可購買抗熒光猝滅封片劑。
儀器：
烤片機、通風櫥、免疫組化染色缸或盒、微波爐、濕盒、熒光顯微鏡、微波爐。
步驟
若為冰凍切片，則進行以下步驟后直接進行第二大步、第 5 步內源性過氧化物酶阻斷
一、加固定劑（按下述固定劑選擇固定條件，任選其一）：
10% 中性緩沖福爾馬林：在室溫下固定 10 min；
冷凍丙酮：-20℃ 冷凍 10 min，風干；
甲醇：-20℃ 冷凍 10 min；
3% 甲醛：室溫下固定 15 min；
3% 甲醛/甲醇：在 3% 甲醛溶液中室溫固定 15 min，之后直接放入甲醇溶液中 -20℃ 固定 5 min。
二、1xPBS 清洗 2 次，每次 5 min。
1、選取質量較好，厚度均勻的組織切片并做好標記，同時設立一張陰性對照切片；使用不同抗體的切片盡量選取連續(xù)切片，避免因組織差別大而影響結果分析的客觀性；
2、石蠟溶解：將切片置于 70℃ 原位雜交儀中，烤片 30 min (無烤片條件也可忽略此步直接進行(2)，適當增加脫蠟時間)；
3、脫蠟：將烤過后的切片迅速放入二甲苯中，2 次，各 5 min。
4、梯度水化：100%、90%、80%、70% 的乙醇中各放置 5 min，蒸餾水中放置 5 min；
5、內源性過氧化物酶阻斷：滴加 3% 過氧化氫，室溫于濕盒內放置 10 min 后，蒸餾水中放置 1 min；
6、抗原修復：放置于 1 x CB 中，微波爐 80% 火力 4 min，40% 火力 8 min，冷卻至室溫；
7、（可選步驟）0.3% Triton室溫通透 15 min；
8、封閉：吸干組織周圍液體，滴加 10% NGS，放置于濕盒內，37℃ 30 min或室溫 2 小時；
9、一抗：按抗體說明書建議比例使用 1% NGS 稀釋抗體；吸干組織周圍液體，滴加稀釋好的一抗，其中陰性對照組僅滴加 1% NGS，放置于濕盒內，37℃ 孵育 2 小時，或 4 攝氏度過夜；
10、放置于 1xPBS 中清洗 3 次，每次 5 min；
11、二抗：吸干組織周圍液體，加入稀釋好的熒光二抗，室溫避光孵育1h 后，1xPBS 洗三次，每次 5 min；
12、染核：加入 Hoechst 熒光染料標記細胞核，室溫孵育 15 min 后 1xPBS 洗兩次，每次 5 min；
13、封片：滴加一滴抗熒光猝滅封片劑于組織上，蓋玻片封片，置于顯微鏡下觀察拍照。
注意事項
1、若使用熒光標記的一抗，則孵育完成后，1xPBS 清洗 3 次每次 5 min，直接進行染核和封片。
2、為了長期保存，請在 4℃ 下避光保存樣品。
3、若無抗熒光猝滅封片劑，則滴加一滴 1xPBS 后覆以蓋玻片，置于顯微鏡下觀察拍照，另外，注意避免長時間照射樣品，防止熒光過快猝滅。
4、注意調整抗體的稀釋比例，盡量按照實驗室已摸索的稀釋比例、抗體說明書以及文獻中比例配制。
5、若想同時檢測多種抗原，則需選擇種屬來源與樣本組織不同的抗體，按抗體各自的說明書推薦終濃度混合后滴加至組織上進行孵育；二抗也按各自稀釋比例混合后進行孵育，注意各熒光二抗波長需不同。
6、拍照時注意調節(jié)光強及曝光時間等參數。
常見問題
1、組織細胞無著色：可能實驗操作問題，包括實驗操作不當、實驗材料異常、抗體選擇和抗體質量問題等，或者本身蛋白不表達，這些均可通過設置陽性對照以及陰性對照實驗來排除。
2、 染色過淺：可能由于封閉時間過長，抗體濃度過低，抗體孵育溫度不當或時間過短，操作過程中緩沖液殘留過多或者間接稀釋抗體濃度；應根據具體原因進行調整。
3、染色過深：可能由于封閉時間過短，抗體濃度過高，抗體孵育時間過長，洗滌不充分（洗滌次數少或時間短），或者濾光片選擇不合適；應根據具體原因進行調整。
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