5分鐘了解\\透射電鏡的廣泛應(yīng)用

時(shí)間：2023-07-21 熱度：858

簡(jiǎn)介：

透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,簡(jiǎn)稱TEM),可以看到在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清的小于0.2um的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長(zhǎng)更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡，電子束的波長(zhǎng)要比可見(jiàn)光和紫外光短得多，并且電子束的波長(zhǎng)與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說(shuō)電壓越高波長(zhǎng)越短。目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。

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TEM工作原理：由電子槍發(fā)射出來(lái)的電子束，在真空通道中沿著鏡體光軸穿越聚光鏡，通過(guò)聚光鏡將之會(huì)聚成一束尖細(xì)、明亮而又均勻的光斑，照射在樣品室內(nèi)的樣品上；透過(guò)樣品后的電子束攜帶有樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息，樣品內(nèi)致密處透過(guò)的電子量少，稀疏處透過(guò)的電子量多；經(jīng)過(guò)物鏡的會(huì)聚調(diào)焦和初級(jí)放大后，電子束進(jìn)入下級(jí)的中間透鏡和第1、第2投影鏡進(jìn)行綜合放大成像，最終被放大了的電子影像投射在觀察室內(nèi)的熒光屏板上；熒光屏將電子影像轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光影像以供使用者觀察。

腦組織取材及應(yīng)用

腦組織取材法：在一般情況下，腦組織先進(jìn)行灌注固定（4%多聚甲醛溶液），待固定完成后應(yīng)馬上打開(kāi)顱骨，暴露出所要取材的位置，根據(jù)取材的要求以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康母钊∠鄳?yīng)的部位，如研究腦神經(jīng)軸索、髓鞘以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，建議取材于腦組織白質(zhì)部分，此處有髓神經(jīng)纖維相對(duì)較多，膠質(zhì)細(xì)胞比較豐富；如要研究神經(jīng)元以及血腦屏障結(jié)構(gòu)，建議取材于腦皮質(zhì)的灰質(zhì)部分，而且最好做定向包埋，以神經(jīng)元長(zhǎng)軸方向（大約為腦組織的矢狀面）作為切面方向，這樣可以很好地觀察神經(jīng)元細(xì)胞核、軸突以及樹(shù)突結(jié)構(gòu)的變化，突觸以及毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)也比較容易見(jiàn)到。

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圖：暴露于 AgNP 的動(dòng)物腦組織的代表性 TEM 顯微照片顯示 RER（箭頭）和擴(kuò)大的高爾基體復(fù)合體（G）的腫脹碎片。

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圖：自噬抑制劑對(duì)腦組織的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察小鼠腦組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病理變化。在 JEV+Rapa 和 JEV 組觀察到腦組織線粒體嚴(yán)重?fù)p傷，在 JEV+Wort 和 JEV+CQ 組觀察到腦組織線粒體輕微損傷（紅色箭頭，線粒體；比例尺，2 μm）。

睪丸及附睪組織取材及應(yīng)用

睪丸及附睪組織取材方法：由于睪丸組織比較松軟，固定難度較大，目前大多采取灌注固定法進(jìn)行固定，但此方法如果處理不當(dāng)，很可能會(huì)造成固定不良，原因是睪丸的血供離心臟比較遠(yuǎn)，固定液難以到達(dá)，睪丸曲細(xì)精管基膜比較厚，固定液難以滲透，導(dǎo)致固定不良。我們還可以采用注射固定法即用注射針直接插入睪丸內(nèi)部，從多個(gè)方向進(jìn)行注射固定液，然后割取觀察部位進(jìn)行進(jìn)一步浸泡固定；另外一種方法就是直接割取觀察部位進(jìn)行浸泡固定，需要注意的是，取材的睪丸組織必須切的很細(xì)，讓固定液直接滲透入曲細(xì)精管的斷面，這樣，各層生殖細(xì)胞都會(huì)得到很好的固定，不過(guò)比較麻煩的就是每次操作后都要離心處理。另外需要注意的是，要觀察生精細(xì)胞，必須取材于睪丸的睪丸網(wǎng)部位，如果取材于直精小管部位，就看不到生精細(xì)胞了。大鼠與小鼠的睪丸網(wǎng)比較表淺，就在白膜下附近。如果要觀察成熟精子，最好取材于附睪的尾部，此處精子已基本成熟，而且精子密度最高。

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圖：附睪 Prm1 缺陷精子染色質(zhì)濃縮和 ROS 誘導(dǎo)的 DNA 損傷分析。(A) Prm1+/+、Prm1+/- 和 Prm1-/- 附睪精子的代表性透射電子顯微照片。(B) 來(lái)自 Prm1+/+、Prm1+/? 和 Prm1?/? 雄性 (n=3) 的附睪精子 DNA 濃縮的定量；對(duì)每名男性 100 個(gè)精子進(jìn)行了分析。(C) Prm1?/?附睪精子的透射電子顯微照片。(D) 載有從 Prm1+/-、Prm1-/-、Prm2+/-、Prm2-/- 和通過(guò)電泳分離的 WT 雄性附睪精子分離的基因組 DNA 的瓊脂糖凝膠。載有梯子 (L) 的其他車(chē)道已從圖像中剪下。(E) 8-OHdG 陽(yáng)性精子在 Prm1+/+、Prm1+/- 和 Prm1-/- 小鼠 (n=3) 的附睪頭和尾部組織切片上的百分比。(F) 來(lái)自 Prm1+/+、Prm1+/- 和 Prm1-/- 雄性的睪丸、附睪頭和附睪尾組織切片中針對(duì) 8-OHdG 的代表性 IF 染色。

肺組織取材及應(yīng)用

肺組織取材：肺組織取材比較困難，因?yàn)榉谓M織內(nèi)部氣體無(wú)法徹底排放而導(dǎo)致組織懸浮于固定液表面，使得固定液不能及時(shí)滲透進(jìn)組織內(nèi)部而導(dǎo)致大部分組織固定不良或無(wú)法固定。目前提倡的還是主動(dòng)脈灌注固定。如果條件不成熟，只能采取浸泡固定。組織取出后盡量切得小，同時(shí)利用震蕩的方法將組織沉入固定液中，還有一種方法就是將組織放在載玻片上，并將固定液滴在其上，用另外一片載玻片輕輕壓在上面并輕輕擠壓，一壓一松，可以看到固定液內(nèi)有小氣泡溢出，直到小氣泡消失為止，但必須注意力度不能太大，否則組織的細(xì)胞將會(huì)被破壞。在固定之前，取材者必須清楚自己的研究目的，從而采取相應(yīng)部位進(jìn)行取材。如果以研究支氣管黏膜為主的（這里指肺內(nèi)的支氣管），盡量取材于靠近肺門(mén)部位，這里有具有軟骨的大支氣管，在肺葉的內(nèi)側(cè)1/2部分，有小支氣管、細(xì)支氣管以及終末細(xì)支氣管；如果主要研究肺泡上皮細(xì)胞、終末細(xì)支氣管、呼吸性細(xì)支氣管以及肺泡隔的結(jié)構(gòu)等，建議取材于肺葉靠近胸膜一側(cè)或者肺尖部；如果研究肺動(dòng)脈內(nèi)皮或壁的結(jié)構(gòu)，建議取材于肺門(mén)附近的肺葉組織，這里的大小動(dòng)脈數(shù)量比較多，而遠(yuǎn)側(cè)肺呼吸部的動(dòng)脈極少。

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圖：小鼠肺組織（10000x，比例尺 = 2 μm）、細(xì)胞核 (Nu)、層狀體 (LBs) 和線粒體 (Mt) 的透射電子顯微鏡圖像。

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圖：小鼠肺組織透射電子顯微鏡的代表性顯微照片。高氧組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表現(xiàn)出鐵死亡典型的線粒體形態(tài)異常（黑色箭頭），包括線粒體萎縮、密度增加和膜結(jié)構(gòu)破裂、線粒體嵴減少。LB，片狀體。

腎組織取材及應(yīng)用

腎組織取材：腎外包被一層薄膜，主要由纖維組織和少量平滑肌組成。一般腎標(biāo)本取材部位在腎實(shí)質(zhì)，實(shí)質(zhì)由皮質(zhì)與髓質(zhì)兩部分組成，一般取材部位在腎皮質(zhì)，皮質(zhì)位于腎的外周，其厚度因動(dòng)物種類不同而有差異，一般在1mm—4mm。腎組織除了采取灌注固定外，直接浸泡固定的效果也是比較滿意。腎組織取材相對(duì)比較簡(jiǎn)單，一般臨床上均采用穿刺術(shù)，然后根據(jù)需要切取皮質(zhì)或髓質(zhì)進(jìn)行觀察。

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圖：BSHX減輕腎臟的組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)。(A)腎臟外觀和大小的初步觀察。(B)腎臟的蘇木精和伊紅(HE)染色(×400)。(C)高碘酸希夫(PAS) ) 腎臟染色 (×400)。(D) 腎臟透射電子顯微鏡（比例尺，2 μm）。（E）腎臟透射電子顯微鏡（比例尺，500 nm）。

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圖：巨噬細(xì)胞耗竭可改善糖尿病小鼠的腎臟損傷并減少 M1 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。(A) 小鼠腎組織的組織病理學(xué)染色和透射電子顯微鏡 (TEM)。蘇木精-伊紅（HE）染色（放大倍數(shù)：200×）；高碘酸席夫（PAS）染色（放大倍數(shù)：400×）；馬松三色（Masson）染色（放大倍數(shù)：200×）；過(guò)碘酸-甲胺銀（PASM）染色（放大倍數(shù)：400×）；透射電子顯微鏡圖像（放大倍數(shù)：4000×）。（B）小鼠腎臟的F4/80免疫組化染色。原始放大倍數(shù)：200×.(C)CD68/iNOS 小鼠腎組織共免疫熒光染色。

動(dòng)脈取材及應(yīng)用

動(dòng)脈取材法：動(dòng)脈遍布全身，直徑大小不同，一般小動(dòng)脈（直徑小于１mm）切成長(zhǎng)約2mm短柱狀即可。如果是大動(dòng)脈，可以將動(dòng)脈剖開(kāi)，沿著縱軸將動(dòng)脈壁切成約長(zhǎng)2mm寬１mm的長(zhǎng)條形。注意在取材時(shí)盡量使用鋒利的刀片，且不要擠壓血管，由于血管內(nèi)皮比較脆弱，容易受傷脫落。

圖：培養(yǎng) 5 天后豬的再細(xì)胞化動(dòng)脈。動(dòng)脈腔側(cè)的代表性掃描電子顯微鏡 (SEM) 圖像：(A) 沒(méi)有細(xì)胞的脫細(xì)胞動(dòng)脈，(B 和 C) 非聚合物涂層的再細(xì)胞化動(dòng)脈，白色箭頭指出細(xì)胞之間的間隙，(D) 聚合物-涂層脫細(xì)胞動(dòng)脈，（E 和 F）聚合物涂層再細(xì)胞化動(dòng)脈顯示連續(xù)單層細(xì)胞的形成。（放大倍率；（A、C、D 和 F）x4000，（B 和 E）x1600）。(G 和 H) 垂直于 (G) 天然動(dòng)脈和 (H) 聚合物涂層再細(xì)胞化動(dòng)脈的動(dòng)脈長(zhǎng)軸切割的切片的透射電子顯微鏡 (TEM) 分析。(H) 白色星號(hào)表示兩個(gè)細(xì)胞之間的細(xì)胞粘附，白色箭頭表示細(xì)胞與血管腔側(cè)之間的粘附。L：管腔，EC：內(nèi)皮細(xì)胞，N：細(xì)胞核，ca：細(xì)胞

圖：二甲雙胍保護(hù)股動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)免受繼發(fā)于糖尿病的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)、第 12 周對(duì)照組未治療組（A、B）、糖尿病說(shuō)明了組 (T2DM) (C,D) 和治療組 (Met + T2DM) (E,F)。請(qǐng)注意，（A、E）中的箭頭指向質(zhì)膜，（B）中的箭頭指向被破壞的質(zhì)膜。(A,E) 中的箭頭指向完整的內(nèi)膜表面，(C) 中的箭頭指向受損的內(nèi)膜表面。而 (B,F) 中的箭頭指向完整的質(zhì)膜，而 (D) 中的箭頭指向不規(guī)則形狀的質(zhì)膜。(D,F) 中的星號(hào)分別指向受損和完整的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白絲狀網(wǎng)絡(luò)。N：細(xì)胞核；Lu：血管腔；En：內(nèi)皮細(xì)胞；米：線粒體；RER：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；e：外彈力層；V：液泡；SMC：平滑肌細(xì)胞。(G) 中的直方圖表示對(duì)上述組的內(nèi)膜損傷百分比的定量分析。

骨組織取材及應(yīng)用

骨組織取材：骨組織分布廣，有的較硬，有的較軟，骨組織因?yàn)闊o(wú)機(jī)物沉積較多（主要為鈣鹽的沉積）而較硬，必須經(jīng)過(guò)脫鈣處理（軟骨組織可以不用脫鈣）。首先將骨組織切取一小片，大概1-2毫米大小，經(jīng)過(guò)4%戊二醛固定2小時(shí)以上，再經(jīng)生理鹽水漂洗后放入脫鈣液內(nèi)進(jìn)行脫鈣，一般選擇溫和的EDTA脫鈣液脫鈣，也可利用酸類進(jìn)行脫鈣，至于判斷脫鈣程度如何，可以使用鑷子夾住骨片，輕輕將兩端向中心壓攏，感覺(jué)其彈性強(qiáng)度進(jìn)而判斷脫鈣程度。脫鈣完成后先經(jīng)生理鹽水漂洗后再用4%戊二醛固定2小時(shí)，然后按常規(guī)方法進(jìn)行處理。

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圖：(A) 感染性骨骼的光學(xué)顯微鏡圖像（放大倍數(shù) × 40）。(B) (A) 的放大倍率。骨髓炎患者骨細(xì)胞的透射電子顯微鏡圖像（放大倍數(shù) × 5000）。(C) (B) 的放大倍數(shù)。骨細(xì)胞核周區(qū)域的透射電子顯微鏡圖像?？梢?jiàn)的腫脹線粒體簇，嵴耗盡，基質(zhì)密度降低。箭頭示例性地指示線粒體（放大倍數(shù) × 20,000）。

游離細(xì)胞處理及應(yīng)用

游離細(xì)胞處理及應(yīng)用：組織培養(yǎng)和游離細(xì)胞（如血細(xì)胞、脫落細(xì)胞以及細(xì)菌病毒等），常懸浮分散在介質(zhì)中，首先必須將其凝集成團(tuán)，然后進(jìn)行固定，具體做法如下：1、血漿凝集法：將抗凝全血離心分層（2000轉(zhuǎn)/每分鐘，10—20分鐘），用毛細(xì)吸管沿著管壁輕輕的將上清液吸取，接著用吸管吸取固定液，并沿著管壁將2.5%戊二醛固定液慢慢地加入進(jìn)行固定，然后把它放在4℃冰箱內(nèi)保存。2、血漿（血清）混合法：如為細(xì)菌、病毒、脫落細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞則先將它們制成懸液放置于離心管內(nèi)（最好是玻璃的），離心成團(tuán)（1000～3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分鐘左右，離心，再棄去多余的固定液，然后和少量抗凝血漿或血清混合均勻，離心成團(tuán)，去上清液，用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿著離心管壁緩慢滴入，盡量避免團(tuán)塊分散，靜置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?p style="text-align: center"> 企業(yè)微信截圖_16899112673537.png

圖：A：SMMC-7721細(xì)胞核基質(zhì)絲的TEM觀察；B：HMBA處理的SMMC-7721細(xì)胞核基質(zhì)絲的TEM觀察；C：SMMC-7721細(xì)胞中間絲的TEM觀察；D：HMBA處理的SMMC-7721細(xì)胞中間絲的TEM觀察；E：SMMC-7721細(xì)胞中NM-IF系統(tǒng)的TEM觀察。L：葉片；NM：核基質(zhì)；IF：中間燈絲；F：HMBA處理的SMMC-7721細(xì)胞NM-IF系統(tǒng)的TEM觀察。

外泌體的應(yīng)用

游離細(xì)胞處理及應(yīng)用：外泌體是直徑約為 30~200 nm，密度在 1.13~1.21 g/mL 的小囊泡。外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等，外泌體是活細(xì)胞分泌的來(lái)源于晚期核內(nèi)體（也稱為多囊泡體）的膜性囊泡。通過(guò)透射電鏡我們可以清楚直觀的看到外泌體的典型結(jié)構(gòu)。

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圖：提取的血清囊泡的電子顯微鏡圖像。外泌體的典型尺寸直徑小于 100 納米。

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圖：從乳腺癌細(xì)胞 (BCC) 和 MCF-7/TAMR-1(M/T) 細(xì)胞中分離的外泌體的特征。(A) 從 BCC 和 M/T 細(xì)胞中分離的外泌體的代表性圖像，使用透射電子顯微鏡拍攝和外泌體直徑范圍（右欄）。比例尺 = 500 nm（左列）和 200 nm（中間列）。 (B) 用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)到的 BCC 和 M/T 細(xì)胞及其外泌體中外泌體標(biāo)記物的表達(dá)。

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