慢病毒包裝的實驗步驟：

（1）構(gòu)建含有目的基因的慢病毒載體。

（2）大量擴增慢病毒載體：根據(jù)實驗將包裝慢病毒過程中需要用到的3個質(zhì)粒進行高純度無內(nèi)毒素抽提。

（3）293T細胞內(nèi)進行慢病毒載體的大量包裝：按一定比例將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染指數(shù)生長期的293T細胞。

（4）慢病毒的濃縮及純化：PEG8000濃縮法/蔗糖密度梯度超速離心法。

（5）慢病毒滴度測定：采用GFP熒光計數(shù)、絕對定量qPCR和RT-qPCR等進行慢病毒滴度測定。圖 293T細胞慢病毒包裝過程（E Martínez-Molina et al., 2020）。

慢病毒包裝過程中的常見問題：

1、如何計算需要加入的病毒量？

通過MOI計算。MOI（Multiplicity of Infection，感染復數(shù)）是指每個細胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達量越高，證明細胞越難被感染。一般我們把某株細胞有80%被感染時所用的病毒顆粒數(shù)和細胞數(shù)目的比值作為該株細胞的MOI。

相關(guān)計算公式：

每孔所加病毒量（μL）=MOI×細胞數(shù)/病毒滴度（TU/mL）×1000

MOI=（病毒滴度×病毒體積）/細胞數(shù)目

病毒滴度可通過熒光計數(shù)法進行確定。
2、慢病毒感染細胞，鋪板密度是多少？

通常根據(jù)細胞增殖的速度調(diào)整細胞鋪板密度，以保證在感染后3天左右細胞剛好快長滿培養(yǎng)皿底部為宜。

針對大部分細胞系：傳代周期在2~3天，感染時細胞鋪板的密度保持在30~50%左右；

針對某些原代細胞：由于細胞增長緩慢，可以在接種時提高匯合度到70~80%左右；

針對非分裂細胞：如神經(jīng)元細胞，接種后不再增殖，此時可以按照100%的匯合度進行接種。

3、向細胞中加入慢病毒的最佳時間是什么時候？

一般慢病毒感染細胞后可在2~3天觀察到所攜帶基因的熒光表達情況，即在細胞狀態(tài)良好，匯合度為30~50%時加入慢病毒，以確保在感染后2天時細胞增長達到70%左右的匯合度，即是最佳時間。

4、慢病毒感染細胞后基因表達多久到達峰值？

慢病毒感染后大部分細胞GFP或目的基因的表達在3天左右達到峰值，但若是細胞生長緩慢，達到峰值的時間就會延長。

5、慢病毒感染細胞后為什么GFP熒光信號弱？

一般與進入宿主細胞內(nèi)慢病毒顆粒數(shù)較少、自身的增殖狀態(tài)較差、細胞種類、觀察時間較早、目的基因表達或者特殊結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)。一般慢病毒感染細胞3天左右熒光信號最強。

6、慢病毒包裝出毒量很低？

可能與以下幾個方面有關(guān)：

（1）細胞狀態(tài)：一般293T細胞的活力、增殖狀態(tài)、鋪板密度、是否處于對數(shù)生長期等對病毒的產(chǎn)量影響很大。

（2）質(zhì)粒提取的質(zhì)量：若出現(xiàn)純度不高、濃度過低、未去除內(nèi)毒素、目的基因載體構(gòu)建的不完整等均會導致包裝出毒量很低。

（3）目的基因：目的基因的片段大小、序列及翻譯的蛋白是否含有毒性均會影響包裝效果。目的基因片段過大（＞2.5k）可能會導致包裝滴度下降，甚至無法包裝。目的基因翻譯的蛋白產(chǎn)生細胞毒性，可能會導致細胞增殖異常以至于包裝出毒量很低。

（4）收毒時間：收毒時間過早，會導致出毒量很低。一般在轉(zhuǎn)染后24h觀察細胞生長狀態(tài)和熒光信號強弱，若細胞生長狀態(tài)良好，第一次可在48h收集病毒上清，第二次可在換液后72h收集病毒上清。

7、慢病毒感染細胞效率低？

可能與以下因素有關(guān)：

（1）細胞類型：某些原代細胞和干細胞自身較難轉(zhuǎn)染，導致慢病毒感染細胞效率低，可加大病毒量或采用濃縮病毒進行感染。

（2）細胞生長狀態(tài)：細胞感染前生長狀態(tài)異常，如存在支原體污染、細胞鋪板密度過大等。

（3）病毒質(zhì)量：慢病毒滴度不高，操作時應盡量避免凍融，建議分裝儲存。

應用案例：

圖：慢病毒被注射到正確的位置（黑質(zhì)）。（A）黑質(zhì)中 TH 陽性神經(jīng)元（紅色標記）的免疫熒光。（B）RAGE-siRAGE 慢病毒載體（綠色標記）和 TH 神經(jīng)元的合并圖像黑質(zhì)（放大倍數(shù)：100×）PMID: 32410941

圖：KLF2增強bEnd.3細胞中的自噬溶酶體途徑。分別用慢病毒-Klf2或慢病毒-Klf2 shRNA轉(zhuǎn)染bEnd.3細胞以過表達或敲低KLF2表達。(A) 慢病毒-Klf2 轉(zhuǎn)染的 bEnd.3 細胞中自噬溶酶體通路標記物（LC3、p62、CTSD 和 LAMP2）的蛋白質(zhì)印跡和定量。 (BC) 用慢病毒-Klf2 轉(zhuǎn)染的 bEnd.3 細胞中 MDC (B) 和 Lyso-Tracker (C) 染色的代表性圖像和量化。 (D) 用慢病毒-Klf2 轉(zhuǎn)染的 bEnd.3 細胞中 LC3 和 LAMP1 的代表性免疫熒光圖像和定量。 (E) 用慢病毒-Klf2 shRNA 轉(zhuǎn)染的 bEnd.3 細胞中自噬溶酶體通路標記物（LC3、p62、CTSD 和 LAMP2）的蛋白質(zhì)印跡和定量。 (FG) 用慢病毒-Klf2 shRNA 轉(zhuǎn)染的 bEnd.3 細胞中 MDC (F) 和 Lyso-Tracker (G) 染色的代表性圖像和量化。 (H) 用慢病毒-Klf2 shRNA 轉(zhuǎn)染的 bEnd.3 細胞中 LC3 和 LAMP1 的代表性免疫熒光圖像和定量。 PMID: 35530152

圖：TM 細胞中多功能蛋白聚糖的慢病毒 shRNA 沉默。(A) 將指定稀釋度的多功能蛋白聚糖 shRNA 慢病毒添加到培養(yǎng)的豬和人 TM 細胞中，并在 48 小時后通過 qRT-PCR 評估多功能蛋白聚糖 mRNA。值表示相對于模擬感染的 TM 細胞的比率。(B–G) 豬 (B–D) 和人 (E–G) TM 細胞在培養(yǎng)物中的免疫熒光，使用針對 (B,E) 模擬感染細胞的多功能單克隆抗體，(C,F) 對照慢病毒感染細胞和 (D,G) versican shRNA 慢病毒感染細胞。感染后 72 小時進行免疫熒光。PMID: 21596823

圖：PHLDA1 抑制 AKT 的磷酸化。(A) 顯示 PHLDA1 mRNA 結(jié)構(gòu)的基因組瀏覽器軌跡和 PHLDA1 蛋白結(jié)構(gòu)的示意圖。(B,C) 免疫熒光染色顯示強 pAKT 表達很少與 PHLDA1 表達共定位。(D,E) 轉(zhuǎn)染 shPHLDA1 的視網(wǎng)膜類器官中 pAKT 的免疫熒光。與用 Scramble shRNA 轉(zhuǎn)染的細胞相比，PHLDA1 KD 的表達顯著增加。比例尺 = 20 μm。Arrowheadsindicate 由慢病毒 (mCherry+) 轉(zhuǎn)染的細胞。(F,G) 用慢病毒轉(zhuǎn)染過表達 PHLDA1(OE) 的視網(wǎng)膜類器官中 pAKT 的免疫熒光。比例尺 = 20 μm。Arrowheadsindicate 由慢病毒 (mCherry+) 轉(zhuǎn)染的細胞。(H, I) Y79 中具有 PHLDA1 過表達 (OE) 的 pAKT 的蛋白質(zhì)印跡分析。使用FLAG抗體檢測外源性過表達的PHLDA1。(J, K) AKT 激活和抑制對光感受器分化的影響。W12 視網(wǎng)膜類器官用 AKT 激動劑 SC79（SC，10 μM）或拮抗劑 MK2206（MK，1 μM）處理 2 周。PMID: 36331259

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以上介紹了什么是慢病毒？以及其在醫(yī)學科研中常用的一些應用實例，希望對大家有所幫助！