最新的組織透明成像技術(shù)

時間：2023-11-13 熱度：866

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今天聊聊最新的組織透明成像技術(shù)。

為啥要組織成像

從哲學(xué)的角度來看，人的認(rèn)識是一個從簡單到復(fù)雜，然后又從復(fù)雜到宏觀的循環(huán)，在這個循環(huán)中，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對人體結(jié)構(gòu)和功能有了更深層次的理解，自然也就有了從更大的角度，去研究細(xì)胞、組織，乃至器官之間的生理和病理過程。藥物制造也很好地反映了這一哲學(xué)進(jìn)程。所以，大型、厚組織的影像，就成了必然的發(fā)展方向。

組織成像的挑戰(zhàn)和方法

顯微鏡作為眼見為實的最佳工具，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著極為重要的作用。生物樣品歸根結(jié)底都是三維的，但是因為不透明組織或者厚尺度樣品對光的散射，想要對深層組織成像是個很大的挑戰(zhàn)。以往常用的辦法就是先把厚的組織切成很多2-D的薄切片后再用顯微鏡看，這樣做的缺點就是制樣成像過程慢，破壞整體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，重建繁瑣不精確，樣品損毀不可重復(fù)用。目前基于這種物理切片方法中，使用最先進(jìn)成像系統(tǒng)（如fMOST）處理一整個鼠腦也需要一周多的時間。

顯微鏡最好的“眼見為實” 工具，它在生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著極其重要的作用。生物樣本最終具有三維結(jié)構(gòu)，但由于不透明或厚度較大存在光散射等問題，難以實現(xiàn)對深層組織的成像。傳統(tǒng)的方法是將較大的組織切割成二維的薄片，然后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，但這種方法存在制作速度較慢、對整個內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成損傷、重構(gòu)復(fù)雜且不能重復(fù)使用等問題。目前，利用fMOST等先進(jìn)影像技術(shù)對全鼠大腦進(jìn)行分析，耗時超過一周。

在過去的一百多年里，科學(xué)家們試圖通過各種方法將樣本變得透明，這樣才能更好的觀察到物體的全貌，但直到最近十年，都沒有任何進(jìn)展。兩個技術(shù)方面的原因：一是由于光學(xué)顯微鏡自身的原因，二是由于化學(xué)因素造成的。

另一種方法是利用激光共焦、雙光子、轉(zhuǎn)盤式等光學(xué)顯微術(shù)來實現(xiàn)集成成像。然而，現(xiàn)在的顯微鏡卻有一個無法克服的問題，那就是組織過厚，導(dǎo)致了反應(yīng)遲鈍和光漂白。和光學(xué)比起來，化學(xué)才是最難解決的。不同組織的厚樣本會導(dǎo)致觀察結(jié)果受到以下因素的影響：

還有一種方法

1、色素能吸收可見光，阻礙入射光線，比如血紅蛋白、肌紅蛋白、黑色素等。

2、由內(nèi)源熒光分子（膠原、酪氨酸，黃素等）或者在制樣過程中引入的熒光信號（戊二醛，多聚甲醛等）產(chǎn)生的背景信號。

3、最關(guān)鍵的是，大部分生物樣本中含有油脂，呈現(xiàn)乳白色或者不透明，這就造成了高信噪比的成像困難，這也成為了進(jìn)行深層組織顯像的主要瓶頸。該現(xiàn)象的產(chǎn)生源于光的散射，即光線在分子、細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞等不同的生物組織中，會受到不同程度的折射，散射和吸收，造成了巨大的信號損失。

現(xiàn)代透明技術(shù)

光在同一種物質(zhì)中傳輸，方向不可能是一百年，因此，將不同器官的折射率調(diào)整到同一或相近，才能克服上述技術(shù)難題，這才是現(xiàn)代透明技術(shù)的最終目標(biāo)。下面是透明化示例：

由于不同樣本的化學(xué)內(nèi)部環(huán)境差異較大，且分子在不同內(nèi)部環(huán)境下具有不同的特性，因此，不同的透明工藝對不同樣品的影響與變形也不盡相同。該研究方向可以分為兩大類：一是借鑒Spalteholz近似理論，發(fā)展出一種新型的基于水的透明技術(shù)。其中，水基透光法有3種：1）無源將待測樣品侵入折射率相匹配的溶液中，2）先除去油脂，然后再進(jìn)行水化，3）對試樣進(jìn)行主動或被動脫油，最后將試樣浸入折射率相匹配的溶液中。

水基透明法是一種無毒的、對被測物不產(chǎn)生變形（部分會導(dǎo)致試樣體積膨脹）、不會對浸入式顯微鏡的物鏡造成損害。然而，該方法的透明性較差，僅能用于小型樣品，且前處理流程繁瑣，操作難度大，耗時數(shù)周。

透明的溶劑通常可以獲得更好的光學(xué)效應(yīng)，比如大腦中富含脂肪的物質(zhì)。但它的氣味很難聞,而且有毒，會破壞物鏡的正常結(jié)構(gòu)，還會讓一些樣本變小。其中一大局限在于，在脫水性的同時，去除了對蛋白質(zhì)發(fā)光至關(guān)重要的水分子。隨著透明技術(shù)的迅速發(fā)展，3DISCO、iDISCO等基于溶劑的透明方法在很大程度上解決了這一問題，但仍存在諸多的不足。

新的透明化技術(shù)正在被開發(fā)出來，用來解決老技術(shù)中存在的一些問題，比Pegasos、3DISCO、FluoClear、 uDISCO、 Scale 、SeeDB、CLARITY、CUBIC、SWITCH、CUBIC-R、Bone Clarity等。

透明化的步驟在此不具體講解了，感興趣的話其實可以專門開一篇文章，下圖是個簡單的透明化流程說明。

透明化組織成像

透明化技術(shù)的進(jìn)步，也促進(jìn)了影像學(xué)的進(jìn)步?，F(xiàn)有的透明物體成像方法主要有共焦法、雙光子法和片光法等。

共聚焦和雙光子

當(dāng)樣本變得透明后，光學(xué)散射效應(yīng)被大大降低，制約其成像性能的關(guān)鍵是樣本的擺放位置和物鏡的工作距離。當(dāng)前大多數(shù)顯微鏡生產(chǎn)企業(yè)已開發(fā)出超長工作距離（>5毫米）、高 NA （>0.8）的光學(xué)顯微鏡。因此，無論是激光共焦技術(shù)還是雙光子技術(shù)，都可以用于透明物體的成像。在透明材料中，由于其具有更高的激發(fā)效率和較小的多色串色幾率，因此其在透明材料中的應(yīng)用將更加廣泛。除非是在不太透明的情況下，或者是用到了近紅外光。

然而，目前最大的問題就是其成像速度。1000mm3大鼠的大腦，如果用20x/1.0NA的目標(biāo)像，需要4200,000幅圖像（假定視場為500um，步長為1um。）因此，激光共焦與雙光子技術(shù)僅能對透明樣本的一小部分進(jìn)行探測。簡單地說，用共焦技術(shù)或者雙光子技術(shù)來觀察幾毫米乃至幾厘米大小的樣本，就像是拿著一把解剖刀去劈柴一樣。

光片顯微鏡

光學(xué)顯微鏡的巨大優(yōu)勢在于對透明化樣品的速度。不管是自搭建還是商業(yè)化光學(xué)顯微鏡，都可以做到20幀以上。Luxendo公司的MuVi-SPIM-CS雙攝像機（見下圖），能夠?qū)崿F(xiàn)2048×2048幀的全幀圖像（超過70幀/幀）比如在正常情況下，它可以在四小時掃描一顆完整的老鼠大腦（單色，60ms，100個視野，2300個z軸，4μ m）

傳統(tǒng)的片光顯微鏡都是通過柱面反射鏡和低信噪比來獲得片晶，因此其成像分辨率較低。隨著新型光片顯微術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展（振鏡式或空間3光調(diào)制模塊可產(chǎn)生光片、貝塞爾光片、晶格光片等），分辨率已成為制約其發(fā)展的重要因素。當(dāng)選擇相同的成像物鏡時，在一定的條件下，光學(xué)顯微鏡的分辨率要高于共焦鏡。更為關(guān)鍵的是，通過多個角度的掃描，結(jié)合軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)融合，可以得到XYZ三軸近似的三維成像結(jié)果，這將為大樣本的三維研究，，特別是透明樣本的研究提供更好的手段。

以上就是光片顯微鏡的一般優(yōu)點，但在與透明性結(jié)合使用時，一開始并沒有太大的優(yōu)勢。只是因為1，透明的有機溶劑會破壞鏡片。2、對透明試劑的折射率要求很高。所以一開始，市面上的一些產(chǎn)品，都是水性的，不能用有機溶劑，不然會損壞鏡片。有些使用了隔離玻璃來保護鏡頭不受損傷，但是這種方法會極大地降低清晰度，由于研究的需要，目前已有幾種能夠校正溶液介質(zhì)折射率的超長焦距透鏡，如MuVi-CS所采用的兩種物鏡：

10×/0.5NA，工作距離5.5mm，可通過物鏡校正環(huán)適配折射系數(shù)1.33-1.51;

20x/1.0NA，工作距離 8mm，可通過物鏡校正環(huán)適配折射系數(shù)1.44-1.50;

這樣的物鏡可以匹配目前幾乎所有的透明化成像技術(shù)的溶液，而切通常不會損傷鏡頭。

科學(xué)研究的大數(shù)據(jù)處理是現(xiàn)代影像學(xué)研究中一個不容忽視的重要環(huán)節(jié)。例如，2 kx2K16比特的 sCMOS攝像機，每個圖像的存儲空間為8 MB。就拿透明老鼠大腦來說，10x10的視場，每一個視場的 Z值是2300個，那么攝像機就需要1.8 TB的數(shù)據(jù)。如果你想要多色，多個角度（比如0度，90度），那么你需要的數(shù)據(jù)就會成倍的增加。這給我們提出3個新的問題：1）如何處理每秒接近吉比特的海量數(shù)據(jù)？2)海量的數(shù)據(jù)是如何被存儲的？3)該數(shù)據(jù)是怎樣進(jìn)行分析和處理的？這就造成了，很多人明明有了原始數(shù)據(jù)，卻連一個初步的成果都沒有得到。

要把數(shù)百 G的資料復(fù)制到你的移動硬盤上，就得花上好幾個小時，更別說進(jìn)行分析了。這可不是一臺好的計算機那么簡單，還涉及到 IT基礎(chǔ)設(shè)施，包括數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)、硬件配置、傳輸、存儲、計算等等。但隨著超級計算機、云計算、量子計算機等領(lǐng)域的快速發(fā)展，以及圖像壓縮等技術(shù)的不斷完善，上述問題有望從根本上得到解決。從目前的商業(yè)化產(chǎn)品來看， Luxendo和 Acquifer等公司都提供了一種專門的數(shù)據(jù)存儲和處理方案，其數(shù)據(jù)傳輸速率不低于800 MB/s （可以高達(dá)2 GB/s)，數(shù)據(jù)存儲量達(dá)到 PB，通過 RAID結(jié)構(gòu)來確保數(shù)據(jù)的安全性，還可以通過 GPU并行計算來實現(xiàn)圖像融合與分析。