五分鐘了解//自噬LC3雙標(biāo)腺病毒
A: 自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食（Self-eating）”的現(xiàn)象，凋亡是“自殺（Self-killing）”的現(xiàn)象，二者共用相同的刺激因素和調(diào)節(jié)蛋白，但是誘發(fā)閾值和門檻不同，如何轉(zhuǎn)換和協(xié)調(diào)目前還不清楚. 自噬是指膜（目前來源還有爭議，大部分表現(xiàn)為雙層膜，有時(shí)多層或單層）包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體（autophagosome），最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體（autophagolysosome），降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新。
目前根據(jù)發(fā)生過程分為三類：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。
細(xì)胞的整個(gè)區(qū)域被包圍在雙膜小泡的自噬體中，這些自噬體然后與溶酶體融合成為自噬溶酶體，其內(nèi)容物隨后被其中的蛋白酶降解。即我們說的自噬（autophagy）
是指溶酶體主動(dòng)、直接吞噬胞漿成分的一種方式。
一些分子伴侶，如hsp70，能幫助未折疊蛋白轉(zhuǎn)位入溶酶體。通常說的自噬泛指Macroautophagy。
步驟1：細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后，在胞漿的某處形成一個(gè)小的類似“脂質(zhì)體”樣的膜結(jié)構(gòu)，然后不斷擴(kuò)張，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一個(gè)由2層脂雙層組成的碗，可在電鏡下觀察到，被稱為Phagophore，是自噬發(fā)生的鐵證之一。
步驟2：Phagophore不斷延伸，將胞漿中的任何成分，包括細(xì)胞器，全部攬入“碗”中，然后“收口”，成為密閉的球狀的autophagosome，我把它翻譯為“自噬體”。電鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的鐵證之二。有2個(gè)特征：一是雙層膜，二是內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等。
步驟3：自噬體形成后，可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合（這種情況不是必然要發(fā)生的）。
步驟4：自噬體與溶酶體融合形成autolysosome，期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，2者的內(nèi)容物合為一體，自噬體中的“貨物”也被降解，產(chǎn)物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細(xì)胞重新利用，而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞漿中。
正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，常用的工具藥有：
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
3）Hydroxychloroquine（羥氯喹）
除了選用上述工具藥外，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/p>
由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
4) 利用Western Blot檢測p62蛋白來評(píng)價(jià)自噬以及自噬流的強(qiáng)弱:
起初自噬所降解的底物被認(rèn)為是隨機(jī)的,但是后來的研究表明有些蛋白是seletively降解的,在這些蛋白之中研究的最為透徹的是蛋白p62,p62 is selectively incorporated into autophagosomes through direct binding to LC3 and is efficiently degraded by autophagy ; thus, the total cellular expression levels of p62 inversely correlate with autophagic activity. (一般情況下p62蛋白水平的多少與自噬流的強(qiáng)弱有著反比例關(guān)系)
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