活體顱骨光透明技術(shù)在光學(xué)成像中的應(yīng)用

時(shí)間：2024-05-21 熱度：194

活體腦成像對(duì)于研究大腦生理病理活動(dòng)有著至關(guān)重要的意義。現(xiàn)代光學(xué)成像技術(shù)侵入性低、分辨率高，因而能夠用于活體觀測(cè)生物結(jié)構(gòu)和功能，在腦科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。但是，在活體狀態(tài)下，大腦有顱骨覆蓋，而顱骨對(duì)光的強(qiáng)散射和像差嚴(yán)重限制了光的穿透深度，進(jìn)而影響了皮層成像的分辨率和深度。為了克服顱骨的散射，以往的研究往往需要在成像前建立各類手術(shù)顱窗，主要包括開顱玻璃窗、磨薄顱骨窗以及它們的變體。

磨薄顱骨窗的建立通過(guò)將部分顱骨磨薄至約 25 μm左右，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)皮層的活體高分辨觀測(cè)。但磨薄顱骨窗不適用于大視場(chǎng)觀測(cè)皮層，因?yàn)閷⒋竺娣e的顱骨均勻地磨薄至25 μm的難度非常大。另外，顱骨被磨薄后會(huì)重新生長(zhǎng)，并且新生的顱骨易碎，難以實(shí)現(xiàn)多次的重復(fù)打磨。所以，磨薄顱骨窗不適用于長(zhǎng)期跟蹤觀測(cè)。開顱手術(shù)容易導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而開顱后3天逐漸形成白色絮狀物影響后續(xù)成像效果，且往往會(huì)持續(xù)約 2周，因此并不適合急性模型（3天以內(nèi)）的觀測(cè)及長(zhǎng)期（2周以上）活體成像監(jiān)測(cè)。

近些年興起的組織光透明技術(shù)可以降低生物組織的散射，增強(qiáng)光在組織中的穿透能力，已被廣泛應(yīng)用于離體大組織甚至全器官三維高分辨成像。不僅如此，組織光透明技術(shù)在活體水平也得到了很好的應(yīng)用。研究人員發(fā)展的活體顱骨光透明技術(shù)，以及基于此建立的光透明顱窗，可以在不進(jìn)行開顱手術(shù)的情況下，結(jié)合多種現(xiàn)代光學(xué)成像手段，實(shí)現(xiàn)大腦皮層的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)和功能的無(wú)創(chuàng)成像觀測(cè)。針對(duì)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，開發(fā)了不同的光透明顱窗，可以分別滿足高分辨、大視場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)等要求。相比于開顱玻璃窗，光透明顱窗可以避免手術(shù)帶來(lái)的炎癥反應(yīng)等副作用，從而適用于急性觀測(cè)；而相比于磨薄顱骨窗，光透明顱窗可以通過(guò)反復(fù)操作而觀測(cè)數(shù)月，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期跟蹤監(jiān)測(cè)。

?目前的活體顱骨光透明方法包括以下幾種：（1）SOCS:實(shí)現(xiàn)活體顱骨光透明[1]；（2）SOCW:實(shí)現(xiàn)穿顱神經(jīng)樹突棘成像[2]?；（3）USOCA:可開合的大視場(chǎng)顱窗[3]；（4）VNSOCA:可見(jiàn)-近紅外兼容的光透明顱窗[4]；（5）用于長(zhǎng)期觀測(cè)的光透明顱骨窗（TIS）[5]。本文主要介紹活體顱骨光透明技術(shù)在光學(xué)成像中的應(yīng)用。

（1）激光散斑襯比/高光譜成像

激光散斑血流成像系統(tǒng)采用激光散斑技術(shù)，可以對(duì)組織血流進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，具有非接觸、無(wú)創(chuàng)傷、快速成像等優(yōu)點(diǎn)，可用于記錄由于皮膚營(yíng)養(yǎng)和體溫調(diào)節(jié)等因素引起的毛細(xì)血管、微靜脈和微動(dòng)脈中的血流變化；高光譜成像技術(shù)是一種非標(biāo)記的血氧分布成像技術(shù)。顱骨光透明技術(shù)的出現(xiàn)使其得以在完整顱骨下獲取皮層血流及血氧信息。

圖1. 重復(fù)光透明成像用于皮層血流和血氧監(jiān)測(cè)[3]。（a）顱骨短期重復(fù)透明成像；（b）顱骨長(zhǎng)期重復(fù)透明成像。

利用顱骨光透明技術(shù)，可以持續(xù)一周地每天對(duì)小鼠進(jìn)行顱骨透明化操作并獲取血流血氧信息（圖1. a）。不僅如此，研究人員對(duì) 2 月齡的小鼠進(jìn)行了每月一次、為期 5個(gè)月的持續(xù)成像，并成功觀察到皮層血管網(wǎng)的動(dòng)態(tài)變化，即部分血管的消失和新生（圖1. b）。除了對(duì)單側(cè)顱骨進(jìn)行透明外，研究人員還對(duì)小鼠雙側(cè)顱骨進(jìn)行光透明處理，用于監(jiān)測(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）后雙側(cè)皮層血流及血氧變化（圖2）。

圖2. 光透明顱窗用于監(jiān)測(cè)MCAO引起的皮層血流動(dòng)力學(xué)變化[3]。（a）MCAO前后雙側(cè)皮層血流及血氧變化；（b-c）皮層血流及血氧變化柱狀圖。

（2）光聲成像

光聲成像技術(shù)是近年來(lái)興起的一種新型無(wú)損醫(yī)學(xué)成像方法，兼具光學(xué)的高對(duì)比度和超聲的高穿透性。

光聲成像原理：當(dāng)一束光照射到生物組織上，生物組織吸收光能量而產(chǎn)生熱膨脹，伴隨著熱膨脹會(huì)產(chǎn)生超聲波，吸收光能量的多少?zèng)Q定了產(chǎn)生的超聲波的強(qiáng)度。不同的組織會(huì)產(chǎn)生不同強(qiáng)度的超聲波，可以用來(lái)區(qū)分正常組織和病變組織。

光聲成像技術(shù)檢測(cè)的是超聲信號(hào)（該技術(shù)克服了光學(xué)成像技術(shù)在成像深度與分辨率上不可兼得的不足），反映的是光能量吸收的差異（補(bǔ)充超聲成像技術(shù)在對(duì)比度和功能性方面的缺陷），結(jié)合光學(xué)和超聲這兩種成像技術(shù)各自的優(yōu)點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)組織體較大深度的高分辨率、高對(duì)比度的功能成像。

研究人員將活體皮膚光透明試劑注射到小鼠皮下后，對(duì)皮下血管進(jìn)行光聲成像。結(jié)果表明：在所有檢測(cè)頻率下，光聲信號(hào)都顯著升高，極大地改善了小血管和大血管的可視化，定量分析結(jié)果顯示皮下血管造影深度增加了3~4倍（圖3a）。此外，研究人員還將活體皮膚光透明試劑與超聲凝膠混合后涂抹在小鼠皮膚表面，作為耦合劑使用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在試劑作用后，皮膚略微透明，大、小血管的可視化都得到了改善，并且光聲成像深度顯著增加，血管造影深度提高1.5~2倍（圖3b）。

圖3. 活體皮膚光透明用于光聲成像獲取小鼠皮下血管結(jié)構(gòu)[4]。（a）小鼠皮下注射活體皮膚光透明試劑后，血管光聲成像改善效果。（b）小鼠皮膚涂抹活體皮膚光透明試劑后，血管光聲成像改善效果。

（3）受激拉曼成像

受激拉曼散射成像是一種無(wú)需熒光標(biāo)記的新型生物化學(xué)成像技術(shù)。依據(jù)物質(zhì)中分子化學(xué)鍵振動(dòng)頻率的特異性，可以檢測(cè)生物樣本中的多類物質(zhì)。展現(xiàn)出了無(wú)標(biāo)記、快速、高靈敏度、高特異性等優(yōu)勢(shì)。研究人員通過(guò)受激拉曼成像分析了顱骨光透明過(guò)程中顱骨的主要成分---膠原蛋白和羥基磷灰石（鈣質(zhì)）的變化，對(duì)顱骨光透明技術(shù)的作用機(jī)制進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)活體顱骨光透明的基本原理是（部分）去除顱骨中的鈣質(zhì)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使用折射率匹配試劑進(jìn)一步提高透明效果（圖3）。該研究為未來(lái)活體光透明方法的發(fā)展提供了理論依據(jù)，可以用于篩選更高效的活體顱骨及其他組織光透明方法。

圖3. 受激拉曼成像揭示顱骨光透明技術(shù)的機(jī)制[7]。（a-c）幼年小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石顯微結(jié)構(gòu)圖像。顱骨未處理（a），10 %膠原酶處理（b），10 % EDTA處理（c）。（d-f）成年小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石的微觀結(jié)構(gòu)變化。顱骨未處理（d）， USOCA處理（e），10 % EDTA處理（f）。

（4）雙光子/三光子成像

與其它光學(xué)活體成像相比，雙光子/三光子成像具有較高的空間分辨率，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與亞細(xì)胞分辨水平的結(jié)構(gòu)成像研究，以其大穿深、低光毒性、低光漂白等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于活體和活細(xì)胞/組織的成像觀察。一般來(lái)說(shuō)，雙光子/三光子應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究時(shí)需要配合開顱玻璃窗或者磨薄顱骨窗，而活體顱骨光透明技術(shù)的發(fā)展為其應(yīng)用提供了一種新型的非侵入式的觀測(cè)思路。

如圖4所示，活體皮膚光透明技術(shù)能夠顯著提升皮下免疫細(xì)胞雙光子成像的效果。一方面，雙光子成像獲取的圖像信號(hào)強(qiáng)度和信噪比都顯著提高；另一方面，活體雙光子成像的深度也得到極大提升（2~3倍）。

圖4. 活體皮膚光透明用于雙光子成像觀測(cè)小鼠足部免疫細(xì)胞^[1]。

借助活體皮膚光透明技術(shù)，研究人員還研究了糖尿病對(duì)小鼠皮膚免疫功能的影響。在糖尿病小鼠足墊誘發(fā)延遲型超敏反應(yīng)（DTH）后，通過(guò)雙光子成像觀察單核/巨噬細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠DTH后單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和募集增加，但其運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱，說(shuō)明單核/巨噬細(xì)胞免疫功能異常，并且其功能異常隨著糖尿病的進(jìn)展而進(jìn)一步增強(qiáng)（圖5）。通過(guò)體內(nèi)皮膚光透明提高光學(xué)成像深度，可以比較炎癥部位周圍不同深度的單核/巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)行為。對(duì)于正常小鼠來(lái)說(shuō)，在DTH早期（DTH-4 h）皮膚深層單核/巨噬細(xì)胞的遷移距離明顯大于淺層，而在DTH晚期（DTH-72 h）則相反，說(shuō)明不同深度的皮膚免疫反應(yīng)存在差異。

圖5. 活體皮膚光透明用于雙光子成像獲取糖尿病小鼠不同階段（T1D-1 w、T1D-2 w、T1D-4 w）在DTH后不同時(shí)間點(diǎn)（DTH-4 h、DTH-24 h、DTH-48 h、DTH-72 h足部單核/巨噬細(xì)胞募集情況^[6]。

與雙光子成像技術(shù)相比，三光子成像技術(shù)擁有更高的空間分辨率。此外，由于三光子熒光與三次諧波發(fā)光所用的激發(fā)波長(zhǎng)相較于雙光子更長(zhǎng)，因此具有更大的成像深度。這些特征使三光子成像在深層組織和高分辨生物成像領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。而活體顱骨光透明技術(shù)同樣可以用于三光子成像。經(jīng)過(guò)顱骨光透明作用后，三光子成像獲取的皮層血管三次諧波信號(hào)得到顯著增加，而且皮層神經(jīng)元成像的深度和對(duì)比度都得到顯著提升（圖6），這為腦皮層深層信號(hào)的獲取提供了有力的手段。

圖6. 光透明顱窗用于三光子成像[4, 5]。（a-c）顱骨光透明作用前后皮層血管白光圖（a）、三次諧波信號(hào)（b）、神經(jīng)元信號(hào)三維重構(gòu)（c）。

（5）光操控

現(xiàn)代光學(xué)技術(shù)不僅可以獲得高分辨率的神經(jīng)血管圖像，而且可以對(duì)大腦皮層進(jìn)行操控或建立特定的模型?；陲B骨光透明技術(shù)的窗口，也可替代開顱窗和磨薄窗，用于皮層光操控。比如，結(jié)合光透明顱窗和光動(dòng)力效應(yīng)，既可以打開血腦屏障，也可以建立靶向缺血性腦卒中模型；此外，透過(guò)光透明顱窗，將飛秒激光聚焦在血管上，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單根血管的燒蝕，從而建立局部靶向的出血性腦卒中模型。

研究人員利用光透明顱窗，在不開顱的情況下實(shí)現(xiàn)了光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦屏障，并可以在活體水平跟蹤熒光染料的滲漏過(guò)程（圖7. a），隨后進(jìn)一步研究了光動(dòng)力效對(duì)于不同年齡小鼠血腦屏障功能影響的差異性。這些研究為腦藥物遞送和腦疾病的治療提供了一種新的手段。此外，研究人員還將活體顱骨光透明技術(shù)與光栓技術(shù)相結(jié)合，在非開顱的情況下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腦皮層血管的靶向栓塞。通過(guò)改變激光照射位置和照射劑量，可以對(duì)栓塞程度和栓塞區(qū)域進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖7. b），該模型可以用于評(píng)估溶栓藥物對(duì)不同尺寸血管的溶栓治療效果。

圖7. 顱骨光透明技術(shù)用于皮層光操控[8, 9]。（a）光透明顱窗結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦屏障；（b）光透明顱窗結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)實(shí)現(xiàn)光栓模型建立。

展望

活體顱骨光透明技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如神經(jīng)血管成像、皮層光操控、建立特定的疾病模型等，為活體皮層觀測(cè)提供了一個(gè)無(wú)需開顱的光學(xué)窗口。不同的腦科學(xué)研究對(duì)顱窗提出了不同的要求。比如，神經(jīng)突觸成像需要高分辨觀測(cè)，許多疾病的研究需要長(zhǎng)時(shí)程跟蹤，急性病理模型需要建窗口立即觀測(cè)，神經(jīng)功能成像需要在清醒動(dòng)物上開展，跨腦區(qū)研究需要較大的觀測(cè)視場(chǎng)。而光透明顱窗發(fā)展至今，已同時(shí)具備了高分辨、大視場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程、適用于急性觀測(cè)的優(yōu)勢(shì)，因而有望在某些傳統(tǒng)顱窗無(wú)法勝任的場(chǎng)合（比如急性創(chuàng)傷性腦損傷的跨腦區(qū)觀測(cè)）提供重要的技術(shù)支撐，從而在未來(lái)的腦科學(xué)研究中大放異彩。但是，仍舊要意識(shí)到目前顱骨光透明技術(shù)依然有所限制。比如，目前尚未有適用于更大動(dòng)物（比如大鼠、獼猴等）的活體顱骨光透明方法，這需要研究人員繼續(xù)探索更高效的顱骨光透明方法。未來(lái)更好的顱骨光透明的出現(xiàn)，結(jié)合更多的成像方法，會(huì)為腦科學(xué)的發(fā)展提供更有力的技術(shù)保障。

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