雙光子熒光顯微鏡(TPM)是激光掃描顯微鏡，局部激發(fā)基于雙光子吸收的熒光團。目前，TPM以其優(yōu)異的穿透性和光學切片能力，成為活體完整組織或活體動物亞細胞分辨率下無創(chuàng)觀察細胞和器官結構和功能活動的有力工具。

TPM已經(jīng)在各種應用中得到了應用。神經(jīng)科醫(yī)生使用TPM來監(jiān)測突觸、軸突、樹突、棘、神經(jīng)活動和神經(jīng)網(wǎng)絡。在不同的刺激下，如觸覺、食物、電和視覺模式，動物的反應行為伴隨著功能性神經(jīng)尖峰和結構變化[1-5]。因此，特定的行為與特定的神經(jīng)反應有關。這些聯(lián)系提供了重要的信息，可能表明神經(jīng)系統(tǒng)如何處理來自外部世界的信息，并激活來自單個神經(jīng)系統(tǒng)內部的命令。TPM作為神經(jīng)科學的一種工具，發(fā)揮著極其重要的作用。此外，采用TPM觀察免疫效果。

1.雙光子吸收和雙光子顯微鏡

1929年，在哥廷根理論物理研究所，Maria G?ppert-Mayer研究了兩個光子同時被一個分子吸收的量子可能性[15]。然而，雙光子吸收的可能性極低，需要極高的峰值光強度來實現(xiàn)演示。直到1961年，Kaiser和Garrett在1960年5月Maiman發(fā)明激光后不久，才在實驗中首次實現(xiàn)了雙光子吸收[16]。1990年，Denk和Strickler和Webb將雙光子吸收與激光掃描共聚焦熒光顯微鏡相結合，具有前所未有的能力[17]。從那時起，配備了皮秒或飛秒脈沖、高功率激光器的雙光子顯微鏡已經(jīng)成為生物學和醫(yī)學領域三維高對比度、高分辨率、快速成像的標準工具。

圖1.雙光子激發(fā)和雙光子顯微鏡。(a)單光子激發(fā)示意圖和雙光子激發(fā)。(b)雙光子顯微鏡系統(tǒng)。(c) (a)單光子圖像熒光和雙光子熒光。(來源于文獻[18])

如圖1.a所示，一個熒光團分子被一個光子激發(fā)到一個高能狀態(tài)。在這種狀態(tài)下停留很短的時間后，通過非輻射弛豫，熒光團轉移到基態(tài)，并在納秒內發(fā)射熒光光子。由于弛豫能的損失，激發(fā)光子的能量大于發(fā)射光子;換句話說，激發(fā)光的波長比發(fā)射光的波長短。對于單光子激發(fā)，發(fā)射熒光的強度與激發(fā)激光的強度成線性正比。

如果一個光子的能量不足以將熒光團激發(fā)到激發(fā)態(tài)，則不會發(fā)生激發(fā)和發(fā)射。然而，如果兩個光子的能量足夠，則可能發(fā)生激發(fā)。為了更容易理解，我們可以假設一個功率不足的光子將熒光團推到持續(xù)很短時間的虛狀態(tài)。在此期間，如果該虛態(tài)熒光團遇到另一個功率不足的光子，并且這兩個光子的能量足以激發(fā)，則可能發(fā)生激發(fā)，如圖1.a所示。對于雙光子激發(fā)，發(fā)射熒光的強度與激發(fā)激光強度的平方成正比。不同分子的雙光子激發(fā)概率用橫截面表示，單位為GM (G?ppert-Mayer)或10 x 50 cm4 s/光子。例如，EGFP (Clontech)在927 nm波長下的雙光子激發(fā)截面約等于39 x 10 x 50 cm4 s/光子。由于這種極低的概率，雙光子吸收是罕見的，很難觀察到。為了提高雙光子吸收，一種方法是使用具有更高雙光子橫截面和適當波長的明亮標記進行照明。另一種方法是在空間和時間上聚焦激光，形成更密集的光子通量。實際上，高na(數(shù)值孔徑)物鏡用于緊聚焦激光，以在空間上增加光子密度。同時，脈沖激光被用來暫時增加光子的密度。

一個典型的雙光子顯微鏡系統(tǒng)如圖1.b所示，由Ti:藍寶石激光器、galgal反光鏡、物鏡和光電倍增管(PMT)組成。脈沖激光光斑被樣品平面上的反射鏡掃描，熒光被收集，然后由于其靈敏度投射到PMT上。然后，將PMT記錄的信號重新組織成時間序列，形成圖像。例如，由于其穩(wěn)定性和靈活性，將重復頻率為80 MHz，脈沖持續(xù)時間為~100 fs，平均功率為50 mW的鎖模Ti:藍寶石激光器用于雙光子顯微鏡，該激光器由532 nm的激光器泵浦，產(chǎn)生700-1300 nm的脈沖激光。掃描儀，通常是一個兩軸galvom鏡或聲光偏轉器(AOD)，將激光光斑重定向到標本平面上的不同橫向位置。對于體成像，需要軸向掃描機制，通常使用壓電、電可調透鏡(ETL)、空間光調制器(SLM)、可調聲學梯度折射率透鏡(TAG)或遠程聚焦。有不同的掃描策略，如逐行掃描或逐目標掃描。最常用的逐行掃描以有限的成像速度產(chǎn)生足夠的采樣。高速逐目標成像僅掃描先前對大腦區(qū)域掃描確定的一些固定位置，以定位單個神經(jīng)元[19]。

由于雙光子熒光的稀缺性，雙光子顯微鏡中的檢測器必須具有很高的靈敏度。pmt和雪崩光電二極管(apd)在低光子探測中得到了廣泛的應用。PMT使用多個外部放大器，以近1ns的短響應時間將一個電子提升到數(shù)百萬個。TPM的一個優(yōu)點是光學切片能力。如上所示，雙光子吸收是困難的，只有靠近激光焦點的區(qū)域才有足夠的光子進行有效的雙光子激發(fā)，因此收集到的熒光只來自于如圖1.c所示的焦點區(qū)域。因此，在遠離焦點的區(qū)域沒有足夠的TPM激發(fā)，從而導致較少的光漂白和光毒性。這種光學切片能力非常類似于在單光子共聚焦顯微鏡，但源于雙光子激發(fā)沒有針孔。TPM具有光學切片能力，在一般情況下提供高信噪比的圖像，對比度令人滿意。

TPM的另一個優(yōu)點是它對樣品的滲透深度長。事實上，不均勻的生物組織散射光，導致退化的約束激發(fā)光子密度和成像對比度。在散射中占主導地位的瑞利散射與波長成反比，TPM中使用的紅外光的波長比傳統(tǒng)的單光子顯微鏡(如共聚焦顯微鏡)中使用的可見光的波長長。此外，與單光子成像相比，雙光子成像中波長較長的激發(fā)光被生物組織的主要成分水吸收較少。這兩大特性使得TPM中的紅外光激發(fā)更深。這種特性對于需要深穿透深度的應用至關重要。

因此，TPM特別適用于活體和原位深部埋深、分布較厚的組織的成像目標，如皮層下神經(jīng)元的成像。此外，由于光效率的關系，光漂白和光毒性不是光子預算的主要考慮因素。但是，應考慮線性吸收引起的熱損傷。據(jù)報道，平均功率的安全限制為2-5 mW/μm2，脈沖能量密度的安全限制為0.025-0.06 nJ/μm²。

圖2.基于TPM的ao輔助共聚焦和TPM。(a)的雙色共聚焦成像少突膠質細胞(洋紅色)和神經(jīng)元核(綠色)(來源于參考文獻23)。(b) TPM三維圖像堆棧和不同深度的圖像來自于體積為810μm³的體內神經(jīng)元成像vS1皮質與系統(tǒng)AO和完全AO校正。(來源于參考文獻26)

在神經(jīng)科學中，視覺刺激，例如旋轉光柵圖案，虛擬現(xiàn)實場景或LED信號，對于發(fā)現(xiàn)行為與神經(jīng)元反應之間的聯(lián)系和關系至關重要。然而，包括斑馬魚在內的大多數(shù)動物在單光子顯微鏡下都能看到光源，這就提出了一個問題，即神經(jīng)元是對視覺刺激模式做出反應，還是僅僅對單光子激光激發(fā)源做出反應。相比之下，在雙光子顯微鏡下，紅外光源是不可見的，這就排除了光源干涉的可能性。

由于存在不均勻的折射率和組織散射，激發(fā)光經(jīng)常發(fā)生畸變，難以有效聚焦。扭曲的點擴展函數(shù)(PSF)降低了光子強度，導致信號急劇下降，直到信號在一定深度完全淹沒在噪聲中。自適應光學(AO)系統(tǒng)通常用于處理這種情況。在檢索或重建樣品誘導的波前后，通過使用有源光學元件(如空間光調制器或可變形鏡)在系統(tǒng)中施加補償波前來抵消攝動[22-25]。此外，雙光子激發(fā)熒光還可以作為另一種成像模型的指導，如圖2.a, b所示。2018年，Janelia Research Campus的Betzig小組[26]報道了一種結合點陣光片和基于tpm的AO的系統(tǒng)。將TPM的熒光發(fā)送到Shack-Hartmann波前傳感器重建局部區(qū)域的波前，并對激發(fā)和發(fā)射路徑進行補償，充分挖掘晶格光片的功率。

圖3.空間和時間聚焦和復雜。(a)基于雕刻PSF技術的時間聚焦示意圖，激光束撞擊光柵、物鏡的后焦平面和焦平面的時空截面剖面圖。(b)使用微透鏡陣列的多焦點空間復合。(c)多脈沖時間復合。(d)基于衍射受限psf的采樣和基于雕刻psf的采樣的比較。(來源于參考文獻28)

2. 圖像采集速度

掃描顯微鏡的一個主要缺點是成像速度的限制。通過使用掃描裝置，例如galgal鏡，激光焦點在整個視場中逐點移動感興趣區(qū)域(ROI)。為了獲得可接受的熒光強度，探測器的積分時間應該足夠長，以接收多個熒光光子。通常，當使用重復頻率為80 MHz的激光源時，TPM產(chǎn)生12 MHz的有效像素率;換句話說，幾乎5-6個脈沖的熒光產(chǎn)生一個像素。

近幾十年來，已經(jīng)開發(fā)了許多技術來解決這個問題。2005年，康奈爾大學的Chris Xu小組[27]報道了空間和時間聚焦(TeFo)技術，以減少背景以獲得更好的穿透。一個光學光柵被用來形成“彩虹”光束，平行光束按波長線性位移。每個光譜分量都是空間聚焦的，但不是很好地重疊，這增加了光子的軸向限制。TeFo提供了一個示例來說明如何在空間和時間上調制PSF。

基于TeFo, 2016年洛克菲勒大學的Vaziri小組[28]通過雕刻PSF技術演示了單脈沖每體素激發(fā)(圖3. d)，以單細胞分辨率實現(xiàn)了快速體積速率和大體積(3-6 Hz, 0.5 x  0.5 x  0.5 mm³)。利用TeFo(雕刻型PSF ~5 x 5 x 10μm³，高斯型PSF ~5 x 5 x 70μm³)對PSF進行軸向約束和側向擴展，以激發(fā)最小體素并解析目標，如圖3.3a所示。注意，在這種情況下，激光的重復頻率相對較低(4.1 MHz)，以增加一個脈沖中的光子通量。通過稍微降低空間分辨率，雕刻的PSF為快速、大體積成像提供了一個概念框架。

1998年，Stefan Hell小組[29]繪制了第一張用于多光子顯微鏡的空間復用示意圖。如圖3.b所示，利用旋轉的微透鏡盤對激光進行空間分離，形成多焦激勵，使成像速度提高40 - 100倍。然而，單個焦點的能量急劇下降，這對信噪比和穿透都是有害的。2007年，W. Amir等人[30]提出了一種時間多重多光子顯微鏡。兩個激光源由兩個相互放置的脈沖序列組成，這些脈沖序列指向樣品的不同平面，通過對記錄的信號進行解復用得到實際分布。這種方法提供了脈沖可以重新排序和分離的概念(圖3.c)。Vaziri團隊在2019年通過結合時空復用、PSF雕刻和遠程掃描技術達到了一個里程碑[31]。一方面，利用光柵對光按波長進行故意分散，形成軸向受限、橫向擴展的點擴展函數(shù);然后，通過減少橫向采樣來提高成像速度。成功實現(xiàn)PSF雕刻的關鍵是使用低重復率激光和PSF軸向限制，以確保足夠的光子強度。另一方面，將脈沖分成多個光路以獲得不同的時間延遲，然后通過定制的鏡子沿不同的空間方向定向。時空復用為特定的成像需求提供了靈活的配置。通過結合雙光子/三光子顯微鏡中的PSF雕刻和時空復用，這種混合策略(HyMS)構建了一個集成的概念框架，以適應單細胞分辨率的高速(16.7 Hz, 0.69 x 0.675 x 0.6 mm³,TPM)和大容量(5.1 Hz, 1 x 1 x 0.6 mm³,TPM)成像采集的需求。在這種情況下，空間分辨率為更高的成像速度和更大的體積尺度而受到損害，但仍然足以解決單個神經(jīng)元。HyMS的像素采集速度接近PMT極限，像素在ROI內分布規(guī)律。神經(jīng)元在大腦皮層中只占據(jù)很小的空間，一些采樣像素不提供神經(jīng)元信號。因此，在神經(jīng)科學中發(fā)展了獨特的技術。通常，三維隨機存取多光子熒光顯微鏡(RAMP)[32]充分利用了先前的生物學知識。RAMP使用激光聚焦光柵掃描一個神經(jīng)元，然后將激光焦點重定向到另一個神經(jīng)元進行掃描，如圖4.a所示。隨后，在2019年，Chris Xu小組提出了一種自適應激發(fā)源(AES)，該激發(fā)源可以使激光焦點在空白區(qū)域被抑制，并在神經(jīng)元區(qū)域出現(xiàn)[19]，如圖4.b所示。利用之前的全柵格掃描測量得到神經(jīng)元的占用區(qū)域及其ROI信息。與常規(guī)方案相比，激光阻斷策略大大降低了平均功率，這對于減少熱損傷的縱向神經(jīng)成像至關重要。具體來說，每個神經(jīng)元的平均光子數(shù)高出7倍，而平均功率幾乎降低了4.5倍(30 Hz, 0.7 x 0.7 mm², 18 mW, TPM)。RAMP與AES的結合可進一步提高成像速度和效率。

圖4.條件必選快速TPM。(a)三維隨機存取多光子自定義掃描光子顯微鏡(來源于參考文獻1)。(b)清醒小鼠硬腦膜下750μm神經(jīng)元結構圖像的TPM比較(無自適應激勵源和有自適應激勵源時相同位置的TPM)。比例尺，100μm(來源于參考文獻19)。(c)清醒小鼠具有突觸分辨率的體積功能成像神經(jīng)元中高斯和貝塞爾模塊的最大強度投影(來源于參考文獻33)。(d) faces將脈沖光片重塑為空間分離和時間延遲的焦點x和z方向分辨率略有降低的物鏡焦平面(來源于參考文獻34)。(e)不同成像采集速度和視場的TPM成像參數(shù)優(yōu)化示例。(來源于參考文獻35)

最近，香港大學的Tsia小組和加州大學伯克利分校的Ji小組共同努力，報道了前所未有的超快TPM[34]。一個由一對幾乎平行的鏡子組成的模塊，稱為自由空間角啁啾增強延遲(faces)，用于將一個光脈沖分成80個脈沖，這些脈沖在時間和空間上分離，從而實現(xiàn)水平圖像采樣，如圖4.d所示。然后，使用另一個galvom反鏡進行垂直采樣，這意味著該galvom反鏡的速度決定了圖像采集速度。使用FACED-TPM，神經(jīng)元成像已觀察到高達3000 Hz (80 x 1200像素，50 x 250μm²)，這足以監(jiān)測一些瞬態(tài)活動。在這種情況下，像素采集率達到了PMT硬件的限制。

對于大體積成像，例如中尺度成像，成像速度遠遠落后于要求。最近，Ji組將貝塞爾光束模塊和介觀鏡結合起來進行稀疏標記神經(jīng)元成像，避免了軸向掃描，速度提高了幾十倍[33]，如圖4.c所示。貝塞爾光束模塊將高斯焦點重塑為貝塞爾焦點，并具有細長的軸向分布。與高斯聚焦掃描策略(0.06 Hz, 307幅圖像，301x 405 x 612μm³)不同，貝塞爾焦點橫向掃描(3.2 Hz, 6幅圖像，301 x 405 x 612μm³)的熒光提供了軸向延伸的信息，而不需要實際的物理軸向掃描。貝塞爾光束的核心比高斯光束的核心小，橫向分辨率優(yōu)于高斯光束。由于貝塞爾光束軸向延長，光子密度降低，圖像信背景比(SNR)降低，穿透深度可能成為一個問題。

3. 采集的視野體積

由于采用TPM的掃描形式，可以實現(xiàn)體積視場和成像速度很容易相互交換不同的掃描模式。如從圖4.e可以看出，大視場掃描時，激光聚焦的移動需要更多的時間。演示了針對不同應用優(yōu)化參數(shù)的TPM卡雷爾·斯沃博達在珍妮利亞研究校園報道。例如，用TPM映像1024 x 1024像素，面積0.6 x 0.6 mm²，像素大小0.6 x 0.6μm²幀率為21，而成像由七個條紋組成，每個條紋有1750 x 1750像素，4.4 x 4.2 mm²面積，2.4 x 2.6μm²像素尺寸幀率為1.9[35]。對于成像堆棧，TPM具有752 x 1125 x 307像素，a0.301 x 0.45 x 0.612 mm³的面積，而一個0.4 x 0.4 x 2μm³的像素大小將只有一個幀率為0.06[33]。

4. 采集的深度

如上所述，TPM具有良好的深度滲透性。一般用于小鼠腦成像的TPM深度約為0.6-0.7 mm，信噪比較好[19,31,33]。配備AO系統(tǒng)的先進TPM實現(xiàn)了近衍射限制。如圖2.c所示[25]。Masashi Kondo等[36]在TPM中使用波長較長的激光源紅色指示器，對1.2 mm以內的前額皮質和海馬進行功能性成像，其散射和吸收較少。更長的穿透(1.2 mm)與綠色指示將需要波長更長的三光子激發(fā)[31,37]。

5.結論及未來展望

（1）根據(jù)不同的生物學應用，雙光子顯微鏡的空間、時間、成像深度和視場分別有不同的發(fā)展方向。

（2）微型雙光子顯微鏡提出了實現(xiàn)自由行為動物的高分辨率成像的最新前沿。

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