為了研究MyoAAV 1A在全身給藥后的轉(zhuǎn)導特征和生物分布，作者給成年C57BL/6J小鼠注射了1E+12vg(約4E+13vg/kg)AAV9或MyoAAV 1A-CMV-EGFP，并在注射后2周分析了不同組織中的轉(zhuǎn)基因表達和載體基因組豐度。采集的組織的熒光成像顯示，注射MyoAAV 1A的小鼠肌肉中的熒光強度比注射AAV9的小鼠強得多。重要的是，MyoAAV 1A轉(zhuǎn)導心臟，比AAV9更有效。免疫熒光分析進一步證實了MyoAAV 1A注射小鼠的肌纖維和心肌細胞中有較強的轉(zhuǎn)基因表達(圖2B)。值得注意的是，在C57BL/6J小鼠中，MyoAAV 1A系統(tǒng)顯示出相對較少的肝臟轉(zhuǎn)導(圖2A-2C)。

對雄性和雌性C57BL/6J小鼠不同骨骼肌中EGFP mRNA的定量檢測顯示，注射MyoAAV 1A的小鼠肌肉中的轉(zhuǎn)基因表達量是注射AAV9的小鼠的10-29倍(圖2C)。在注射MyoAAV 1A的動物中，EGFP mRNA在心臟中的表達量是對照組的6.3倍，在肝臟中的表達量是對照組的2.8倍(圖2C)。值得注意的是，MyoAAV 1A的轉(zhuǎn)導效率僅限于橫紋肌組織，并且這種人工衣殼在注射的兔的肺、腎、脾和腦中的轉(zhuǎn)導效率與AAV9相似或更低(圖2C)，這說明在全身給藥以后，MyoAAV 1A會對肌肉組織特異性轉(zhuǎn)導。另外，注射AAV9或MyoAAV 1A的小鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平與對照載體注射的小鼠相比沒有顯著差異，表明注射劑量對肝臟沒有損害。

為了探討MyoAAV 1A用于治療性轉(zhuǎn)基因的可行性，給mdx小鼠注射了攜帶編碼SaCas9構(gòu)建體的AAV9或MyoAAV 1A，以及針對MDX突變5’和3’端的引導RNA(gRNAs)，免疫熒光和WB分析證實，與AAV9-Dmd CRISPR相比，注射MyoAAV 1A-Dmd CRISPR的小鼠肌肉中的抗肌萎縮蛋白的恢復程度更高、范圍更廣。對AAV-CRISPR處理的動物脛骨前?。═A）肌的生理學評估顯示，MyoAAV 1A-Dmd CRISPR注射的DMD小鼠的各項肌肉功能指標均優(yōu)于AAV9-Dmd CRISPR的對照組，這說明MyoAAV 1A在向肌肉輸送治療性基因編輯復合物方面顯示出更顯著的效力。

鑒于在MyoAAV 1A和作者篩選的所有其他變體均存在RGD基序，作者推測RGD結(jié)合整合素異二聚體在MyoAAV 1A轉(zhuǎn)導中起到重要的作用。

作者在HEK293細胞中轉(zhuǎn)染了8種人GRD結(jié)合整聯(lián)蛋白二聚體質(zhì)粒（ɑIIbb3,ɑ5b1,ɑ8b1,ɑVb1,ɑVb3,ɑVb5,ɑVb6,和ɑVb8），然后比較了MyoAAV 1A-CMV-Nluc在HEK293細胞中的轉(zhuǎn)導效率，以pUC19質(zhì)粒為對照。發(fā)現(xiàn)與pUC19轉(zhuǎn)染的對照相比，過表達a8b1, aVb1, aVb3, aVb6或aVb8可以顯著增強MyoAAV 1A-CMV-Nluc的轉(zhuǎn)導效率 (圖4B)。

作者還研究了兩種對原代細胞中MyoAAV 1A轉(zhuǎn)導效率有影響的pan-ɑV整合素拮抗劑（CWHM-12和GLPG-0187）。兩種抑制劑均以劑量依賴性方式阻礙小鼠和人類（圖4C、4D）原發(fā)性骨骼肌肌管中的MyoAAV 1A轉(zhuǎn)導，但不抑制或具有劑量依賴性影響AAV9轉(zhuǎn)導效率。

為了進一步闡明含有ɑV的單個整合素異源二聚體對MyoAAV1A結(jié)合親和力的影響，以ɑVb1、ɑVb3、ɑVb6、ɑVb8重組可溶性整合素異二聚體和麥芽糖結(jié)合蛋白為對照，將人原代肌管與MyoAAV 1A或AAV9預孵育。結(jié)果表明，在具有促進MyoAAV 1A轉(zhuǎn)導能力的含有ɑV的整聯(lián)蛋白異二聚體中，ɑVb6與這個衣殼變體的親和力最高。此外，ɑVb6必須在人肌肉細胞表面才能通過MyoAAV 1A才能實現(xiàn)最佳轉(zhuǎn)導。

在MyoAAV1A基礎上再半隨機突變后,這個第二代變體命名為MyoAAV2A，并將其用于進一步的表征。研究人員分別向C57BL/6J小鼠注射 2×10¹¹vg（約8×10¹² vg/kg）的AAV9-、 MyoAAV1A-或MyoAAV2A-CMV-EGFP，全組織熒光成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)MyoAAV 2A 在不同骨骼肌中的轉(zhuǎn)基因表達水平更高，其轉(zhuǎn)導小鼠骨骼肌和心臟的效率相較于AAV9更高，而在肝臟轉(zhuǎn)基因 mRNA 表達水平較低；載體基因組生物分布顯示，MyoAAV2A 在小鼠骨骼肌和心臟中的 vg/dg 顯著升高，肝臟中顯著降低。此外，MyoAAV2A 轉(zhuǎn)導入原代肌管的效率比 AAV9 高 128 倍，比 MyoAAV1A 高 4.1 倍 。因此,MyoAAV 2A 相較于 AAV9 和 MyoAAV 1A，在肌肉靶向性基因傳遞方面具有顯著優(yōu)勢。

作者將低劑量 （2E+13 vg/kg）的 AAV9-CK8-μDys-FLAG 或 MyoAAV 2A-CK8-μDys-FLAG通過全身遞送到 DMD 的 DBA/2J-mdx 小鼠模型中，WB、RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，注射 MyoAAV 2A 的小鼠肌肉中的微量抗肌萎縮蛋白水平更高，且MyoAAV 2A 在 DBA/2J-mdx 小鼠骨骼肌中輸送的 vg/dg 值 比AAV9 高 12-46 倍，而在肝臟中輸送的 vg/dg比AAV9 低2.5 倍。離心損傷后肌肉比力和力下降百分比的量化表明，與接受相同劑量 AAV9 的小鼠和載體注射動物相比，注射 MyoAAV 2A 的 DBA/2J-mdx 小鼠的 TA 肌肉恢復了顯著更大的比力，并且更能免受損傷。這些結(jié)果表明MyoAAV 2A 在注射低劑量病毒后顯示出巨大的治療潛力。

作者在NHPs篩選出11個對肌肉組織有最高度嗜性的突變體，并在小鼠和NHPs中對這些突變體的轉(zhuǎn)導效率進行了測試?；騧RNA的定量分析結(jié)果顯示，與AAVrh74和AAV9相比，MyoAAV 4A、MyoAAV 4E、MyoAAV 3A和MyoAAV 4C四種突變體在食蟹猴骨骼肌中轉(zhuǎn)導效率最高，在小鼠脛骨前肌、二頭肌、腘繩肌、三頭肌、心臟等肌肉組織中也有很高的轉(zhuǎn)導效率，并且不在肝臟中富集。

研究人員開發(fā)了一種體內(nèi)策略來定向進化和篩選AAVs衣殼變異體，一種向肌肉特異性轉(zhuǎn)導的腺病毒載體—MyoAAV，研究表明示該載體能夠高效靶向肌肉組織，遞送到肌肉組織的效率是傳統(tǒng)病毒載體的10倍以上，且該載體在遺傳性肌肉疾病中的治療劑量要比傳統(tǒng)病毒載體降低大約100到250倍，這一成果極大地降低了肝臟損傷和其他嚴重副作用的風險。研究用到的rAAV9-CMV-EGFP、MyoAAV1A-CMV-EGFP均由宣尊生物提供，宣尊生物可提供靶向肌肉組織的多種血清型AAV和啟動子，從病毒滴度、純度、活性等方面確保病毒包裝質(zhì)量的可靠性，可應用到各種細胞實驗、活體動物的體內(nèi)注射、基因治療等研究領域中。如有需求，歡迎咨詢！

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