染色步驟繁瑣，因此每一步都很關(guān)鍵。在實(shí)驗(yàn)中常出現(xiàn)的問(wèn)題及解決方法如下。

進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時(shí)，必須證明組織內(nèi)顯示陽(yáng)性產(chǎn)物確實(shí)是抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合所產(chǎn)生的。避免假陰性或假陽(yáng)性造成的困擾，要嚴(yán)格對(duì)照實(shí)驗(yàn)才能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出正確評(píng)價(jià)。

掉片是染色過(guò)程中常遇到的問(wèn)題之一。解決方法：

① 使用經(jīng)多聚賴氨酸或APES包被過(guò)載片，黏附效果最好，但價(jià)格相對(duì)昂貴；

② 也可用經(jīng)1%明膠包被的載玻片貼片；

③ 貼有切片的載片從-20℃拿出時(shí)，可先在4℃放置30min,后再放于室溫充分晾干，避免切片因過(guò)快變熱而掉片；

④對(duì)石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)時(shí)，應(yīng)避免修復(fù)液干涸，切片暴露在外，需等修復(fù)液徹底降溫后，再將切片拿出漂洗，禁忌驟熱驟冷引起切片收縮掉片。

關(guān)于抗體涉及以下幾個(gè)方面：

①種屬在進(jìn)行雙重免疫標(biāo)記時(shí)，要選擇來(lái)源于兩種不同種屬動(dòng)物的一抗，如選擇來(lái)源于rabbit和mouse的抗體，二抗則用帶有不同熒光素標(biāo)記的，如抗rabbit或抗mouse二抗， FITC和Tex-Red;

②孵育時(shí)間和溫度兩種一抗可以同時(shí)孵育，然后加入相對(duì)應(yīng)的抗－抗的二抗進(jìn)行孵育，一抗孵育時(shí)間室溫至少需要16h,二抗孵育室溫不宜超過(guò)4h,選擇4℃孵育比較好，背景比較清晰，另外孵育時(shí)夏天特別注意室溫溫度；

③抗體稀釋液通常第一抗體選擇1%牛血清白蛋白進(jìn)行稀釋，第二抗體選擇用0.01mol/LPBS稀釋。

免疫組織化學(xué)染色中的非特異性的問(wèn)題，是決定結(jié)果好壞的關(guān)鍵問(wèn)題，其核心問(wèn)題是交叉反應(yīng)。選擇特異性強(qiáng)、親和力高、稀釋度高的第一抗體是避免非特異染色最有效的方法。實(shí)驗(yàn)中常用到的抗體主要是單克隆抗體和多克隆抗體。單抗是針對(duì)單－抗原決定簇制備的抗體，具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但在提純過(guò)程中易變性，穩(wěn)定性差；多抗是將純化的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中獲得的免疫血清，其可以識(shí)別多個(gè)抗原表位，因此特異性相對(duì)較低、易產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)、重復(fù)性差、每批次都有可能不同。在實(shí)際工作中，可根據(jù)具體需要以及參考文獻(xiàn)的報(bào)道選擇合適的抗體。

其他原因及解決辦法如下：

(1)抗原間的交叉反應(yīng)主要是標(biāo)本固定不當(dāng)或組織抗原封閉不全。每個(gè)抗原有不同的抗原決定簇，也可能有類似的抗原決定簇。因此可以選擇結(jié)構(gòu)相近的抗原做抗體吸收實(shí)驗(yàn)以避免抗原間的交叉反應(yīng)。

(2)抗體與抗原除待檢測(cè)的抗原外，組織中還可能存在類屬抗原，也可與相應(yīng)抗體結(jié)合。通常用2%-5%牛血清白蛋白或二抗來(lái)源的動(dòng)物血清進(jìn)行封閉。

(3)二抗第二抗體產(chǎn)生的非特異性主要是非IgG蛋白或非特異的IgG蛋白之間，通過(guò)特異性反應(yīng)或通過(guò)非特異的疏水鍵與組織或細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生非特異性染色。處理方法同上。

(4)熒光性非特異組織有自發(fā)熒光；部分游離熒光素殘留在二抗中，未與抗體蛋白質(zhì)結(jié)合；抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過(guò)量標(biāo)記的抗體分子帶了過(guò)多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。解決辦法可以通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)或PBS代替進(jìn)行鑒別和排除。注意選擇特異性強(qiáng)、質(zhì)量好、純度高的熒光二抗。

(5)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶若標(biāo)本因灌流固定不當(dāng)，可能存在紅細(xì)胞和粒細(xì)胞中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶?？梢酝ㄟ^(guò)甲醇-H202處理切片，避免DAB反應(yīng)形成非特異染色。

片子著色不均勻現(xiàn)象，主要是：

①石蠟切片染色，脫蠟不充分，可以先在60℃烤箱烤1h;

②脫水不徹底，需配置新鮮的梯度酒精；

③貼片孵育抗體時(shí)抗體覆蓋不均勻，切片傾斜，抗體流失等原因，需平放切片，切片擦干后再加抗體，也可以用免疫組化筆（在載玻片上的有組織的邊緣畫圓，防止抗體外溢），既節(jié)約抗體又避免抗體流失；

④冰凍切片漂染，每組切片不宜太多，否則互相重疊，導(dǎo)致接觸抗體不均勻。

切片染色背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色。這主要是：

①抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或抗體濃度過(guò)高；

②抗體質(zhì)量差或變質(zhì)；

③DAB濃度過(guò)高，顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或反應(yīng)時(shí)溫度過(guò)高；

④ PBS沖洗不充分，殘留抗體增強(qiáng)著色；

⑤ 切片染色過(guò)程中出現(xiàn)干片，而導(dǎo)致非特異性著色增強(qiáng)；

⑥切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太久（大于24h),不可室溫長(zhǎng)時(shí)間放置。

石蠟切片抗原修復(fù)方法很多，從弱到強(qiáng)有胰酶修復(fù)、微波修復(fù)、高壓修復(fù)。修復(fù)液也分若干種，如pH6.0袧橡酸鈉修復(fù)液、pH8.0的乙二氨四乙酸二鈉(EDTA)修復(fù)液、pH9.0的EDTA-Tris修復(fù)液等，修復(fù)時(shí)間也根據(jù)標(biāo)本、抗原、抗體等選擇。

各個(gè)步驟之間的漂洗非常重要，可以防止一抗、二抗殘留試劑引起的非特異著色。如果染色抗體種類較多，切片組別較多時(shí)不僅漂洗時(shí)間要足夠，而且還可以單獨(dú)漂洗，防止抗體之間的交叉污染。