免疫熒光染色-間接法
原理：基本原理是先用特異性抗體與細胞內(nèi)相應抗原結合，再用熒光素標記的二抗與特異性抗體相結合，形成抗原-特異性抗體-標記熒光抗體的復合物。因為在復合物上帶有比直接法更多的熒光標記物，所以比直接法更靈敏。
方法一：用NGS封閉
PBS洗一次；
加入固定液（固定液：0.1%戊二醛+3%多聚甲醛 in PBS），固定10min；
加入0.1% NaBH4 ，7min；并從此步開始搖勻；
PBS洗3次，5min/次；
加入破膜液（破膜液：0.2% triton in PBS），15min；
加入封閉液（0.05% triton+10% NGS in PBS），90min；
加入一抗，60min；一抗使用抗體稀釋液稀釋200倍/500倍（抗體稀釋液：0.05% triton+5% NGS in PBS）；
Washing buffer（0.05% triton+1% NGS in PBS）洗5次，15min/次；
加入二抗，30min；使用抗體稀釋液將二抗稀釋500倍/1000倍；
Washing buffer 洗5次，15min/次；
PBS 洗1次，5min；
如需要做STORM則需要進行二次固定，停止搖勻；
加入固定液，10min；
PBS洗3次，5min/次；
H2O洗2次，5min/次。
方法二：用BSA封閉
1. 將培養(yǎng)基洗凈：PBS快洗一次，然后慢洗3次，5min/次；
2. 固定細胞：4%多聚甲醛固定15min；（4% PFA配置：8g多聚甲醛，8g蔗糖，溶于200 ul PBS）
3. 同1；
4. 破膜液破膜45min（破膜液：用6% BSA將20% triton稀釋80倍）；
5. 加入一抗，1h（6% BSA 將抗體稀釋100倍）；
6. PBS快洗1次，慢洗3次，10min/次；
7. 加入二抗，1h（6% BSA 將抗體稀釋100倍）；
8. 同6；
免疫染色實驗可能會遇到的問題
樣品染色結果信號弱或者無信號：
原因：
1）細胞或組織樣本保存時間過長；
2）抗體濃度偏低，參照抗體說明書，再根據(jù)樣本表達量進行摸索；
3）一抗孵育時間太短，加長孵育時間，或者建議4℃ 過夜孵育。
染色結果背景偏高：
原因：
1）封閉不充分；加長封閉時間（注意，封閉需要在搖床上搖勻）
2）抗體濃度過高；參照抗體說明書，再根據(jù)樣本表達量進行摸索；
3）抗體孵育時間過長或溫度過高；
4）清洗不充分；可適量多清洗幾次
5）樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中
非特異性染色較多：
原因：
）固定液殘留，這里需要縮短固定時間或者在封閉液中加甘氨酸，做抗原修復也可以幫助解決非特異性染色；
多輪標記：
在多輪標記實驗中，要注意抗體種屬的問題，兩種一抗種屬不同或者雖然種屬相同但抗體亞型不同，可以一起染，二抗也是，需要用與一抗對應的種屬及亞型。
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