參考見(jiàn)解：最好是同一視野在未用熒光激發(fā)下進(jìn)行對(duì)照，看是否非特異性染色。

（1）空白對(duì)照：如果你作的是石蠟切片的免疫組化，這一個(gè)對(duì)照必須有，目的是看自發(fā)熒光。脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。

（2）陰性對(duì)照：標(biāo)本直接滴加二抗，呈陰性反應(yīng)。

（3）抗原對(duì)照：標(biāo)本加同種動(dòng)物的未免疫血清，以PBS沖洗后，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動(dòng)物的血清中無(wú)特異性抗體，應(yīng)呈陰性反應(yīng)。

參考見(jiàn)解：只是固定方法不同，細(xì)胞固定用甲醇（多聚甲醛、戊二醛混合液均可），切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。

（1）你的二抗是用FITC標(biāo)記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時(shí)均要避光。

（2）封片最好用甘油加0。5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液，后者能使玻片透明更亮。

（3）關(guān)于免疫酶染色，如果是用過(guò)氧化物酶做標(biāo)記，就必須用3%H₂O₂以去除內(nèi)緣性過(guò)氧化物酶。

（4）如果要做蘇木素復(fù)染，可用鹽酸溶液去除蘇木素。

（1）選取primary antibodies時(shí)要來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物，參考來(lái)源于rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的，參考donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。

（2）兩種primary antibodies同時(shí)孵育，然后兩種secondary antibodies同時(shí)孵育?？贵w濃度、孵育時(shí)間要認(rèn)真摸索， primary antibodies  4度孵育過(guò)夜比較好，背景比較干凈。

（3）陽(yáng)性對(duì)照采用的是陽(yáng)性組織切片，陰性對(duì)照則分別是rabitt和rat的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。

（4）Block用的血清使secondary antibody來(lái)源動(dòng)物的血清，

（5）其余同一般操作。