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狂犬病毒

CAV2逆行標(biāo)記---在神經(jīng)領(lǐng)域的應(yīng)用

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為了確定神經(jīng)回路的輸入輸出組織,本研究自主開(kāi)發(fā)了TRIO(示蹤輸入組織與輸出組織之間的關(guān)系)和cTRIO(特殊性細(xì)胞大熱TRIO)方法。


TRIO鑒別A區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞,A區(qū)的神經(jīng)元與B神經(jīng)元之間有一種突觸聯(lián)系,并向C區(qū)投射。A-B連接是狂犬病病毒(簡(jiǎn)稱RVdG)通過(guò)反向跨突觸示蹤引起的,是狂犬病病毒(簡(jiǎn)稱RVdG)感染引起的一種新的神經(jīng)退行性疾病。B區(qū)初始細(xì)胞可表達(dá)狂犬狂犬病毒糖蛋白(G)及TVA受體(TC),并于RVdG結(jié)合,使B區(qū)初始細(xì)胞與RVdG結(jié)合,使其能夠通過(guò)突觸傳遞至 A區(qū)前突觸神經(jīng)元。


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TRIO中TC、G基因的表達(dá)依賴于Cre,而B(niǎo)去則由AAV介導(dǎo)。Cre是一種重要的神經(jīng)傳導(dǎo)蛋白,其功能主要是通過(guò)犬腺病毒2(簡(jiǎn)稱CAV)介導(dǎo)。然而,TRIO無(wú)法分辨B區(qū)的各種細(xì)胞。


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在cTRIO,將Cre酶的B區(qū)特異的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。在B區(qū)域,TC、G的表達(dá)依賴于CAV-FLEx-loxP-Flp重組酶的特異性C區(qū)域。因此,只有能夠?qū)re轉(zhuǎn)運(yùn)至C區(qū)的B細(xì)胞才能作為RVdG跨突觸示蹤的初始細(xì)胞。


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本研究采用TRIO及cTRIO分別對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)(MC)進(jìn)行干預(yù)。本項(xiàng)目擬通過(guò)體外培養(yǎng)和動(dòng)物模型,將CAV-Cre注入MC,并用AAV-ELEx-loxP-TC/CG注入MC。結(jié)果顯示了MC第2/3層(L2/3)\L5(圖1F,左側(cè);L6為初始細(xì)胞。)


cTRIO(cTRIO)將CAV-FLFxloxp-Flp注入Rbp4-Cre小鼠的cMC和延髓(Me),靶向定位于皮質(zhì)內(nèi)外的L5神經(jīng)元。同時(shí)向MC內(nèi)注入AAV-FLExFRT-T/G;這樣就會(huì)使初始細(xì)胞局限在MCL5(圖1F,中點(diǎn)和右邊),正如Rbp4-Cre的表達(dá)模式所預(yù)測(cè)的那樣。



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通過(guò)控制實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn),在TRIO的CAV-Cre和cTRIO的CAV-FLFxloP-Flp、Rbp4-Cre中,狂犬病毒可以標(biāo)記大部分長(zhǎng)程傳入神經(jīng)元。我們前期研究發(fā)現(xiàn),與TRIO想比,cTRIO能將初始細(xì)胞限定在更多的亞群,且在皮層下及胼胝體向L5神經(jīng)元同時(shí)接收來(lái)自丘腦或皮質(zhì)的信息。TRIO同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在大鼠的胼胝體和紋狀體中,有一種與肥大細(xì)胞相關(guān)的前突觸伴侶。


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此外,我們還發(fā)現(xiàn),CAV的擴(kuò)散具體位置多在200um內(nèi),而且也有可能感染軸索通路。


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我們前期研究發(fā)現(xiàn),CAV-Cre在Ai4小鼠5個(gè)腦區(qū)分別注入CAV-Cre,發(fā)現(xiàn)在上述腦區(qū)投射的神經(jīng)細(xì)胞(部分離注射點(diǎn)>1 cm)都得到了有效的標(biāo)記。因而, CAV能夠遠(yuǎn)距離侵染多種神經(jīng)纖維的軸突及末梢。


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目前已經(jīng)確定了5個(gè)腦區(qū):嗅球、聽(tīng)皮層、海馬、小腦以及延髓,它們都能接收到藍(lán)斑核-去甲腎上腺素的投射。將CAV-Cre注入Ai14小鼠后,發(fā)現(xiàn)藍(lán)斑核內(nèi) NE (NE)能神經(jīng)元。


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相比后腦投射的LC-NE神經(jīng)元,前腦投射的LC-NE神經(jīng)元更偏向背側(cè)。


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本研究為L(zhǎng)C-NE神經(jīng)元的突觸輸入了第一次全腦定量分析。


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這項(xiàng)研究提供的病毒基因工具,也可用于研究哺乳動(dòng)物腦內(nèi)其它環(huán)路,如運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)。TRIO,尤其是 cTRIO,是對(duì)以往選擇性投射定位技術(shù)的拓展,使之可以應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜回路分析。在此基礎(chǔ)上,我們還將使用CAV-FLFxloxp-Flp等多種 Cre轉(zhuǎn)基因小鼠,研究其交叉投射和細(xì)胞類型,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定神經(jīng)元群的調(diào)控。


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