【神經(jīng)示蹤】AAV等病毒在神經(jīng)示蹤領(lǐng)域的應(yīng)用

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大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是由數(shù)目龐大、形態(tài)各異的神經(jīng)元通過突觸連接構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，是大腦行使認(rèn)知、記憶、感覺、情緒等功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。揭示大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，是最終理解大腦處理多種信息相關(guān)機(jī)制的基本前提。由此，神經(jīng)示蹤技術(shù)應(yīng)運而生。

早在1873年，意大利科學(xué)家卡米洛·高爾基首創(chuàng)鉻酸鹽-硝酸染色法，將解剖所得組織中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的胞體與突起染成棕黑色，而未被染色的細(xì)胞呈無色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察、用手繪圖片記錄。這是人類最早研究神經(jīng)通路的形態(tài)和神經(jīng)元間的相互聯(lián)系的技術(shù)。20世紀(jì)80年代，Kristenseson將HSV1注射到小鼠排腸肌，發(fā)現(xiàn)他能通過坐骨神經(jīng)感染脊神經(jīng)背根節(jié)及脊髓背角，而將HSV1注入兔眼時，病毒順行感染視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞、中腦上丘與外側(cè)膝狀體。

近些年來，隨著基因技術(shù)的發(fā)展和綠色熒光蛋白（GFP）基因的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，加上一些新的免疫學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，病毒以其特有的優(yōu)點在神經(jīng)環(huán)路示蹤方面的應(yīng)用越來越廣泛。本文將對常用的病毒以及染料在神經(jīng)環(huán)路示蹤方面的應(yīng)用予以綜述。

神經(jīng)元是具有極性的細(xì)胞,因此神經(jīng)環(huán)路示蹤技術(shù)包括順行標(biāo)記、逆行標(biāo)記、跨突觸標(biāo)記與非跨突觸標(biāo)記等方面。

壹

逆行示蹤

如果要研究某個腦區(qū)是由哪個神經(jīng)元來控制的，就需要反向追蹤。傳統(tǒng)的逆向示蹤方法有熒光染料標(biāo)記、示蹤蛋白標(biāo)記和辣根過氧化物酶（HRP）等。其中Fast blue，F(xiàn)luorogold，霍亂，toxin b, 羰化青，retro beads等[1],HRP可以通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，取材，切片，染色，逆向標(biāo)記神經(jīng)元。

病毒方面，II型犬腺病毒CAV-2與新血清型腺相關(guān)病毒rAAV2-retro可以通過軸突末端侵染神經(jīng)元，從而使其載體通過包漿運輸在神經(jīng)元胞體表達(dá)，結(jié)合熒光蛋白技術(shù)，進(jìn)而實現(xiàn)逆向標(biāo)記[2]。

貳順向示蹤

如果要研究某個腦區(qū)向哪個腦區(qū)進(jìn)行對應(yīng)的功能，就需要采用順行追蹤的方法。傳統(tǒng)的順行示蹤方法有麥角凝集素（WGA）、大豆凝集素（PHA）、生物素葡糖胺（BDA）等。

病毒方面，直接在目標(biāo)腦區(qū)注射帶有熒光蛋白載體的AAV，如AAV-hSyn-EYFP、AAV-DIO-ChR2-EYFP等等即可實現(xiàn)順向示蹤[5]。然而此種順向示蹤技術(shù)并不能排除路過某腦區(qū)而未形成突觸這一現(xiàn)象，需后續(xù)電生理記錄驗證。

單純皰疹病毒（HSV、 VSV）和偽狂犬病毒（PRV）都能實現(xiàn)跨突觸的順行追蹤。2017年1月，美國南加州大學(xué)的李志強(qiáng)教授團(tuán)隊首次報道了一種高滴度的 AAV 1型病毒，它可以在神經(jīng)突觸中進(jìn)行順行示蹤，并在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了攜帶載體的表達(dá)。

結(jié)語：

示蹤是研究腦內(nèi)神經(jīng)環(huán)路的一種重要手段。本項目擬在前期工作的基礎(chǔ)上，通過基因工程、病毒追蹤等手段，通過基因重組、添加特定篩查標(biāo)志、改變病毒感染特征等手段，實現(xiàn)對病毒株的定向改造，以及在基礎(chǔ)與臨床研究中的應(yīng)用，是今后病毒追蹤的重要發(fā)展方向。