【神經(jīng)示蹤】AAV等病毒在神經(jīng)示蹤領(lǐng)域的應用
大腦神經(jīng)網(wǎng)絡是由數(shù)目龐大、形態(tài)各異的神經(jīng)元通過突觸連接構(gòu)成的復雜結(jié)構(gòu),是大腦行使認知、記憶、感覺、情緒等功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。揭示大腦神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),是最終理解大腦處理多種信息相關(guān)機制的基本前提。由此,神經(jīng)示蹤技術(shù)應運而生。
早在1873年,意大利科學家卡米洛·高爾基首創(chuàng)鉻酸鹽-硝酸染色法,將解剖所得組織中神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的胞體與突起染成棕黑色,而未被染色的細胞呈無色,并在光學顯微鏡下觀察、用手繪圖片記錄。這是人類最早研究神經(jīng)通路的形態(tài)和神經(jīng)元間的相互聯(lián)系的技術(shù)。20世紀80年代,Kristenseson將HSV1注射到小鼠排腸肌,發(fā)現(xiàn)他能通過坐骨神經(jīng)感染脊神經(jīng)背根節(jié)及脊髓背角,而將HSV1注入兔眼時,病毒順行感染視網(wǎng)膜節(jié)細胞、中腦上丘與外側(cè)膝狀體。
如果要研究某個腦區(qū)是由哪個神經(jīng)元來控制的,就需要反向追蹤。傳統(tǒng)的逆向示蹤方法有熒光染料標記、示蹤蛋白標記和辣根過氧化物酶(HRP)等。其中Fast blue,F(xiàn)luorogold,霍亂,toxin b, 羰化青,retro beads等[1],HRP可以通過內(nèi)吞途徑進入細胞內(nèi),經(jīng)過一段時間后,取材,切片,染色,逆向標記神經(jīng)元。
病毒方面,II型犬腺病毒CAV-2與新血清型腺相關(guān)病毒rAAV2-retro可以通過軸突末端侵染神經(jīng)元,從而使其載體通過包漿運輸在神經(jīng)元胞體表達,結(jié)合熒光蛋白技術(shù),進而實現(xiàn)逆向標記[2]。
如果要研究某個腦區(qū)向哪個腦區(qū)進行對應的功能,就需要采用順行追蹤的方法。傳統(tǒng)的順行示蹤方法有麥角凝集素(WGA)、大豆凝集素(PHA)、生物素葡糖胺(BDA)等。
病毒方面,直接在目標腦區(qū)注射帶有熒光蛋白載體的AAV,如AAV-hSyn-EYFP、AAV-DIO-ChR2-EYFP等等即可實現(xiàn)順向示蹤[5]。然而此種順向示蹤技術(shù)并不能排除路過某腦區(qū)而未形成突觸這一現(xiàn)象,需后續(xù)電生理記錄驗證。
單純皰疹病毒(HSV、 VSV)和偽狂犬病毒(PRV)都能實現(xiàn)跨突觸的順行追蹤。2017年1月,美國南加州大學的李志強教授團隊首次報道了一種高滴度的 AAV 1型病毒,它可以在神經(jīng)突觸中進行順行示蹤,并在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了攜帶載體的表達。
結(jié)語:
示蹤是研究腦內(nèi)神經(jīng)環(huán)路的一種重要手段。本項目擬在前期工作的基礎(chǔ)上,通過基因工程、病毒追蹤等手段,通過基因重組、添加特定篩查標志、改變病毒感染特征等手段,實現(xiàn)對病毒株的定向改造,以及在基礎(chǔ)與臨床研究中的應用,是今后病毒追蹤的重要發(fā)展方向。
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