Q.細胞轉(zhuǎn)染實驗影響因素有哪些？

A.答案

1）轉(zhuǎn)染試劑
    不同細胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要，因此在轉(zhuǎn)染實驗前應(yīng)根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。
2）細胞生長狀態(tài)
    一般低的細胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔?。最適合轉(zhuǎn)染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。
3）轉(zhuǎn)染方法
    因不同實驗室培養(yǎng)的細胞性質(zhì)不同，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染效果可能不同，應(yīng)根據(jù)實驗室的具體條件來確定最佳轉(zhuǎn)染條件。
4）載體結(jié)構(gòu)
    轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響。

Q.病毒感染細胞實驗中，使用感染增強劑出現(xiàn)細胞毒性的原因是什么？

A.答案

1）增強劑用量過大，可適當(dāng)減少其用量；
2）病毒量過大，可適當(dāng)減少病毒用量，可采用更換培養(yǎng)基或增加培養(yǎng)基量的方法。

Q.用于病毒感染的細胞接種量多少為宜？

A.答案

1）根據(jù)細胞增殖速度決定接種量，一般需保證感染后4天左右細胞剛好快長滿培養(yǎng)皿底部。
2）對于大部分細胞系：傳代周期2-3天，感染時細胞鋪板密度保持在20%-30%范圍內(nèi)。
3）對于某些原代細胞：細胞生長緩慢，接種時匯合度可提升至50%-60%，保證感染后4天左右細胞匯合度達到90%-100%。
4）對于非分裂細胞：接種后不再增殖（如神經(jīng)元細胞），按照匯合度100%進行接種。

Q.加入病毒后，細胞死亡嚴重，是什么原因？該如何處理？

A.答案

一般是病毒對細胞具有一定毒性，可調(diào)整、降低感染MOI值。并密切關(guān)注細胞狀態(tài)，在感染后4、8、12小時定時觀察細胞情況。若出現(xiàn)細胞狀態(tài)變差情況，立即對細胞進行換液處理，使用新鮮的完全培養(yǎng)液替換病毒感染培養(yǎng)液。

Q.如何提高病毒感染效率？

A.答案

病毒感染效率受多個因素影響，包括細胞自身生長狀態(tài)、細胞數(shù)量、細胞被感染的難易程度等。因此在實驗過程中，保證細胞正常增殖、輪廓清晰，同時保持合適的細胞密度，選擇最佳感染條件可更好保證感染效率。
對于懸浮細胞，可采用離心感染的方法，減少病毒感染時的體積，從而提高感染效率。如培養(yǎng)板密封，可用平角轉(zhuǎn)子離心機1000 g離心1 hrs，再放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)正常培養(yǎng)。

Q.細胞能被病毒感染，但為什么GFP熒光很弱？

A.答案

GFP病毒感染細胞后，細胞熒光強度取決于病毒進入細胞顆粒數(shù)、細胞本身的增殖狀態(tài)、細胞類型、觀察時間、GFP基因啟動子活性等因素。因此，目的細胞感染病毒顆粒數(shù)越多、細胞增殖越快，GFP熒光會較強。
其次，病毒在增殖較快的細胞中感染96-120 hrs后，GFP蛋白表達才達到峰值；在增殖較慢的細胞中，這一時間更長。
此外，強啟動子后的GFP基因熒光表達強，反之，弱啟動子后面的熒光表達較弱。

Q.電穿孔轉(zhuǎn)染效果不佳，其影響因素可能有哪些？

A.答案

若電轉(zhuǎn)效果不佳，可考慮一下條件進行優(yōu)化：
1. 電場參數(shù)
    不同細胞系具有不同的最佳場強值，其確定方法除了實驗直接測定比較不同場強下轉(zhuǎn)染率的高低外，還可以采取較為簡便的間接法。文獻顯示存活率在50%左右的電場參數(shù)為理想?yún)?shù)，故可間接測定存活率來確定最佳場強值。
2. 脈沖過程
    ①脈沖波形主要分為兩種，方波脈沖和指數(shù)遞減波脈沖。一般哺乳動物細胞電轉(zhuǎn)選擇方波脈沖，細菌、酵母菌、昆蟲細胞選擇指數(shù)遞減波脈沖。
    ②脈沖時間的選定主要取決與脈沖波形。在方波脈沖中，脈沖時間可直接設(shè)定。在指數(shù)遞減波脈沖中，脈沖時間是指電壓衰減至初始電壓1/3時所用的時間，等于電容（C）與電阻（R）的乘積，單位是ms。在參數(shù)優(yōu)化中，增加電壓應(yīng)當(dāng)降低脈沖時間，而減小電壓則應(yīng)當(dāng)增大脈沖時間。
    ③一般而言，對于大多數(shù)細胞類型都選擇單次脈沖。而在有些情況下可能會用到多次脈沖，因為低電壓、短脈沖時間、多次脈沖可有效避免細胞損傷。多次脈沖建議中間間隔1min。
3. 細胞因素
    用于電轉(zhuǎn)的細胞一般選取處于對數(shù)生長期的細胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。細胞懸液濃度一般為1*10⁶/ml，當(dāng)細胞生長密度大于3*10⁶/ml，轉(zhuǎn)染效率會下降。
4. 質(zhì)粒因素
    從質(zhì)粒濃度看，細胞密度為1*10⁶/ml，DNA用量在2-5 μg/ml轉(zhuǎn)染效率最高。
5. 溫度
    一般情況下，電轉(zhuǎn)的過程是在室溫下進行，但在電擊前后需對細胞進行冰浴處理。
6. 電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)液的選擇
    細胞在電擊后十分脆弱，其培養(yǎng)液的選擇應(yīng)注重提高細胞的存活率，一般選擇 低滲的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可參考加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO。

Q.siRNA導(dǎo)入細胞有哪些方法，哪種最好？

A.答案

siRNA導(dǎo)入細胞有以下幾種方法：化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術(shù)、顯微注射和載體導(dǎo)入技術(shù)。選擇時應(yīng)該依據(jù)實驗條件考慮以下因素：細胞對轉(zhuǎn)入方式的承受能力、細胞對病毒侵染的易感性、細胞的生長特性等。對貼壁細胞來說化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)是最為常用的方法，而對懸浮細胞則采用電穿孔法效果較好。

Q.體內(nèi)轉(zhuǎn)染（Entranster-in vivo）效果如何檢測？

A.答案

一般根據(jù)課題研究要求進行，如果單純檢測轉(zhuǎn)染效率，推薦用qRT-PCR方法和luciferase方法。還可根據(jù)研究，采用組織學(xué)和生理學(xué)，以及物理測量的方法進行。由于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的復(fù)雜性，通常體外試驗中常采用的轉(zhuǎn)染GFP蛋白用熒光顯微鏡觀察的方法，由于體內(nèi)取出的組織材料背景高，檢測較為困難。

Q.影響siRNA轉(zhuǎn)染效率的因素有哪些？

A.答案

1）RNA與轉(zhuǎn)染試劑比例不佳
由于RNA序列差異、合成條件不同以及是否帶有熒光等標記，決定了RNA和轉(zhuǎn)染試劑在不同情況下會有不同的最佳條件，建議先進行預(yù)實驗優(yōu)化。
2）細胞密度不佳
調(diào)整細胞密度到轉(zhuǎn)染時匯合度為20-40%。成功轉(zhuǎn)染siRNA的細胞會產(chǎn)生目標基因表達下調(diào)，但未成功轉(zhuǎn)染的細胞卻不受影響，這時轉(zhuǎn)染效率和總的細胞數(shù)量就很重要，一般細胞數(shù)量較少時轉(zhuǎn)染效率高。由于siRNA沉默時效性的影響，轉(zhuǎn)染后48小時才能進行進行qRT-PCR檢測，轉(zhuǎn)染后48-72小時才能進行蛋白檢測。如果轉(zhuǎn)染時鋪板密度較高，細胞一方面轉(zhuǎn)染效果不理想，直接影響沉默效果和數(shù)據(jù)可靠性，另一方面，48小時甚至更長時間后，沉默檢測最佳點時，過于密集的細胞將影響細胞狀態(tài)，從而影響實驗結(jié)果。
3）RNA效率不高
選擇最優(yōu)RNA，并采用已知高效的RNA做對照。siRNA的合成需要注意的是一定要選用高純度的siRNA，siRNA的純度直接關(guān)系到轉(zhuǎn)染效率和沉默效率。