細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常見問題（一）
A.答案
1）轉(zhuǎn)染試劑
不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。
2）細(xì)胞生長狀態(tài)
一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔?。最適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。
3）轉(zhuǎn)染方法
因不同實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)不同，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染效果可能不同，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件來確定最佳轉(zhuǎn)染條件。
4）載體結(jié)構(gòu)
轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響。
A.答案
1）增強(qiáng)劑用量過大，可適當(dāng)減少其用量；
2）病毒量過大，可適當(dāng)減少病毒用量，可采用更換培養(yǎng)基或增加培養(yǎng)基量的方法。
A.答案
1）根據(jù)細(xì)胞增殖速度決定接種量，一般需保證感染后4天左右細(xì)胞剛好快長滿培養(yǎng)皿底部。
2）對于大部分細(xì)胞系：傳代周期2-3天，感染時(shí)細(xì)胞鋪板密度保持在20%-30%范圍內(nèi)。
3）對于某些原代細(xì)胞：細(xì)胞生長緩慢，接種時(shí)匯合度可提升至50%-60%，保證感染后4天左右細(xì)胞匯合度達(dá)到90%-100%。
4）對于非分裂細(xì)胞：接種后不再增殖（如神經(jīng)元細(xì)胞），按照匯合度100%進(jìn)行接種。
A.答案
一般是病毒對細(xì)胞具有一定毒性，可調(diào)整、降低感染MOI值。并密切關(guān)注細(xì)胞狀態(tài)，在感染后4、8、12小時(shí)定時(shí)觀察細(xì)胞情況。若出現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差情況，立即對細(xì)胞進(jìn)行換液處理，使用新鮮的完全培養(yǎng)液替換病毒感染培養(yǎng)液。
A.答案
病毒感染效率受多個(gè)因素影響，包括細(xì)胞自身生長狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞被感染的難易程度等。因此在實(shí)驗(yàn)過程中，保證細(xì)胞正常增殖、輪廓清晰，同時(shí)保持合適的細(xì)胞密度，選擇最佳感染條件可更好保證感染效率。
對于懸浮細(xì)胞，可采用離心感染的方法，減少病毒感染時(shí)的體積，從而提高感染效率。如培養(yǎng)板密封，可用平角轉(zhuǎn)子離心機(jī)1000 g離心1 hrs，再放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)正常培養(yǎng)。
A.答案
GFP病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度取決于病毒進(jìn)入細(xì)胞顆粒數(shù)、細(xì)胞本身的增殖狀態(tài)、細(xì)胞類型、觀察時(shí)間、GFP基因啟動(dòng)子活性等因素。因此，目的細(xì)胞感染病毒顆粒數(shù)越多、細(xì)胞增殖越快，GFP熒光會(huì)較強(qiáng)。
其次，病毒在增殖較快的細(xì)胞中感染96-120 hrs后，GFP蛋白表達(dá)才達(dá)到峰值；在增殖較慢的細(xì)胞中，這一時(shí)間更長。
此外，強(qiáng)啟動(dòng)子后的GFP基因熒光表達(dá)強(qiáng)，反之，弱啟動(dòng)子后面的熒光表達(dá)較弱。
A.答案
若電轉(zhuǎn)效果不佳，可考慮一下條件進(jìn)行優(yōu)化：
1. 電場參數(shù)
不同細(xì)胞系具有不同的最佳場強(qiáng)值，其確定方法除了實(shí)驗(yàn)直接測定比較不同場強(qiáng)下轉(zhuǎn)染率的高低外，還可以采取較為簡便的間接法。文獻(xiàn)顯示存活率在50%左右的電場參數(shù)為理想?yún)?shù)，故可間接測定存活率來確定最佳場強(qiáng)值。
2. 脈沖過程
①脈沖波形主要分為兩種，方波脈沖和指數(shù)遞減波脈沖。一般哺乳動(dòng)物細(xì)胞電轉(zhuǎn)選擇方波脈沖，細(xì)菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞選擇指數(shù)遞減波脈沖。
②脈沖時(shí)間的選定主要取決與脈沖波形。在方波脈沖中，脈沖時(shí)間可直接設(shè)定。在指數(shù)遞減波脈沖中，脈沖時(shí)間是指電壓衰減至初始電壓1/3時(shí)所用的時(shí)間，等于電容（C）與電阻（R）的乘積，單位是ms。在參數(shù)優(yōu)化中，增加電壓應(yīng)當(dāng)降低脈沖時(shí)間，而減小電壓則應(yīng)當(dāng)增大脈沖時(shí)間。
③一般而言，對于大多數(shù)細(xì)胞類型都選擇單次脈沖。而在有些情況下可能會(huì)用到多次脈沖，因?yàn)榈碗妷骸⒍堂}沖時(shí)間、多次脈沖可有效避免細(xì)胞損傷。多次脈沖建議中間間隔1min。
3. 細(xì)胞因素
用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。細(xì)胞懸液濃度一般為1*106/ml，當(dāng)細(xì)胞生長密度大于3*106/ml，轉(zhuǎn)染效率會(huì)下降。
4. 質(zhì)粒因素
從質(zhì)粒濃度看，細(xì)胞密度為1*106/ml，DNA用量在2-5 μg/ml轉(zhuǎn)染效率最高。
5. 溫度
一般情況下，電轉(zhuǎn)的過程是在室溫下進(jìn)行，但在電擊前后需對細(xì)胞進(jìn)行冰浴處理。
6. 電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)液的選擇
細(xì)胞在電擊后十分脆弱，其培養(yǎng)液的選擇應(yīng)注重提高細(xì)胞的存活率，一般選擇 低滲的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可參考加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO。
A.答案
siRNA導(dǎo)入細(xì)胞有以下幾種方法：化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術(shù)、顯微注射和載體導(dǎo)入技術(shù)。選擇時(shí)應(yīng)該依據(jù)實(shí)驗(yàn)條件考慮以下因素：細(xì)胞對轉(zhuǎn)入方式的承受能力、細(xì)胞對病毒侵染的易感性、細(xì)胞的生長特性等。對貼壁細(xì)胞來說化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)是最為常用的方法，而對懸浮細(xì)胞則采用電穿孔法效果較好。
A.答案
一般根據(jù)課題研究要求進(jìn)行，如果單純檢測轉(zhuǎn)染效率，推薦用qRT-PCR方法和luciferase方法。還可根據(jù)研究，采用組織學(xué)和生理學(xué)，以及物理測量的方法進(jìn)行。由于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的復(fù)雜性，通常體外試驗(yàn)中常采用的轉(zhuǎn)染GFP蛋白用熒光顯微鏡觀察的方法，由于體內(nèi)取出的組織材料背景高，檢測較為困難。
A.答案
1）RNA與轉(zhuǎn)染試劑比例不佳
由于RNA序列差異、合成條件不同以及是否帶有熒光等標(biāo)記，決定了RNA和轉(zhuǎn)染試劑在不同情況下會(huì)有不同的最佳條件，建議先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。
2）細(xì)胞密度不佳
調(diào)整細(xì)胞密度到轉(zhuǎn)染時(shí)匯合度為20-40%。成功轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生目標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)，但未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞卻不受影響，這時(shí)轉(zhuǎn)染效率和總的細(xì)胞數(shù)量就很重要，一般細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)轉(zhuǎn)染效率高。由于siRNA沉默時(shí)效性的影響，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)才能進(jìn)行進(jìn)行qRT-PCR檢測，轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)才能進(jìn)行蛋白檢測。如果轉(zhuǎn)染時(shí)鋪板密度較高，細(xì)胞一方面轉(zhuǎn)染效果不理想，直接影響沉默效果和數(shù)據(jù)可靠性，另一方面，48小時(shí)甚至更長時(shí)間后，沉默檢測最佳點(diǎn)時(shí)，過于密集的細(xì)胞將影響細(xì)胞狀態(tài)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3）RNA效率不高
選擇最優(yōu)RNA，并采用已知高效的RNA做對照。siRNA的合成需要注意的是一定要選用高純度的siRNA，siRNA的純度直接關(guān)系到轉(zhuǎn)染效率和沉默效率。
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