神經領域實驗相關問題
A.答案
轉基因動物依賴的基因重組能夠實現(xiàn)高效且特意的基因重組，但由于轉基因動物難易獲得、動物交配需要大量耗時（至少2代交配才能獲得基因敲除動物）且區(qū)域或組織特異性不高（僅依賴啟動子調控）。
A.答案
（1）有效注射范圍：HRP的注射范圍從注射中心向周圍擴散，濃度遞減。其注射區(qū)的有效范圍是難以確定的問題，故影響對結果的分析。一般認為注射中心深染而不能辯明其結構的區(qū)域為有效區(qū)，而其周圍可辨標記細胞的區(qū)域則為無效區(qū)。
（2）過路纖維問題：路經注射區(qū)的纖維也可攝取HRP并被順、逆向運送。因此，標記部位所出現(xiàn)的神經元或終末，可能并非起于或終止于注射部位。這是在分析結果時經常遇到的問題。
（3）側支標記：HRP標記被一軸突末梢攝入后，在其被逆向運送過程中，有一些可以沿該軸突的側支被順向運至側支的末梢，在側支的末梢部造成終末標記。因此，在一個部位發(fā)現(xiàn)終末標記，并不一定說明發(fā)出這些纖維的胞體位于注射區(qū)內。
（4）跨突觸標記：HRP被運至末梢后，可能被釋放出來，并被下一級神經元攝入，甚至再運送至下一級神經元的末梢。這種現(xiàn)象不多見，主要見于用較靈敏的WGA- HRP作追蹤劑時，而且是在第一級末梢密集，并與第二級神經元的關系密切的情況下出現(xiàn)。例如，視網膜節(jié)細胞末梢內的HRP可能跨突觸地標記外側膝狀體神經元。
A.答案
（1）神經元以外的其它細胞：在注射部位及其附近的膠質細胞、血管內皮細胞、周細胞、巨噬細胞等可攝入HRP，經反應而著色。這對追蹤遠距離纖維聯(lián)系的影響較小，但對短距離聯(lián)系的研究卻有妨礙。一般根據其細胞形狀，尤其是核的形態(tài)及其與血管腔的關系等，易于與神經細胞區(qū)別，而且這些細胞中的反應顆粒常較粗大而大小不均，胞漿也常均勻著色。但有時也可造成鑒別困難，尤其是只有單個細胞時。
（2）神經元的內源性物質：有的神經元含有脂褐素，隨年齡之增長而增多，可能與DAB反應顆粒混淆，在用焦油紫復染的切片上，其暗視野效應還可能加強。在鼠、猴發(fā)現(xiàn)某些神經元內可能含有某種內源性酶或其它物質，也可與DAB-H2O2起反應，產生棕色反應物。黑色素或其前身也有類似反應。這些物質都可能成為偽象的來源。因此，對此法之結果的評定應持慎重態(tài)度。
A.答案
（1）路徑選擇：熒光素也可用于順行示蹤，但標記較弱，因此不推薦。
（2）標記方法：不同熒光素具有不同激發(fā)波長和發(fā)射波長，故可使用雙標或多重標記的方法進行標記。但不同熒光素逆行運輸速度差別較大，實驗時可分兩次手術注入熒光素。
（3）擴散問題：有些熒光素在到達胞體后有擴散出神經元胞體而染出其周圍神經膠質細胞的傾向，因此適當存活時間的選擇很重要。
（4）有效注射部位：由于熒光素分子量較小，逆行示蹤更易擴散，故比HRP法更難確定有效注射部位。同時也存在存在過路纖維攝入問題，分析結果時需要額外注意。
（5）褪色問題：熒光素在激發(fā)光照射下較快褪色，因此允許觀察的時間短。即使在低溫、避光條件下，切片保存時間仍有限，不能長期保存。
（6）優(yōu)化方法：在50 %甘油和50 %的PBS混合液配制的封片劑中加入2.5%三乙烯二胺（triethylene diamine）可有效地延長觀察和保存時間。也可將熒光素包裹在乳膠微球內作追蹤劑，減弱擴散、過路纖維和褪色較快的問題。
A.答案
誘導型 Cre-loxP 系統(tǒng)介導了時間特異性基因敲除，通過對給予誘導劑的時間的控制，人為操控基因敲除的發(fā)生。
（1）四環(huán)素誘導型 tetO-Cre
將四環(huán)素調控系統(tǒng)與Cre-loxP系統(tǒng)相結合，一般需要兩種轉基因小鼠交配使用，即 Cre 工具鼠和rtTA或 tTA小鼠。
在此過程中，具有轉錄激活功能的rtTA或者tTA與tetO結合后激活Cre的表達。同時，這種結合受四環(huán)素或四環(huán)素衍生物強力霉素（Dox）的調節(jié)，因此在 tetO-Cre 與組織特異性 rtTA （或 tTA ）雙轉基因陽性小鼠中，可以通過給予或撤離 Dox 來控制 Cre 重組酶在特定組織中產生的時間。
（2）干擾素誘導型 Mx1-Cre
干擾素誘導是通過 Mx1 基因啟動子對于干擾素的響應來實現(xiàn)的。此方法僅限于響應干擾素的細胞，且其基因敲除效率依賴于組織或細胞對干擾素的響應水平或干擾素響應細胞的數(shù)量。
（3）雌激素誘導型 Cre-ER
將雌激素受體（ER）的配體結合區(qū)與 Cre 重組酶相融合，形成定位于胞漿中的融合蛋白（Cre-ER）。這樣就通過控制雌激素的注射時間，可以實現(xiàn)對基因重組時間特異性的調控。為了避免內源雌激素的干擾，在人ER的配體結合區(qū)進行一個點突變（G521R），使 Cre-ER 只響應外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT）的誘導。
A.答案
剌激頻率和強度和病毒沒有關系，是研究的問題決定的，一般剌激胞體強度5-10 mW，軸突10-l5 mW ，頻率和剌激的細胞特性有關， 5-60 hz不等。
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